私たちのプロトコルは、膀胱の重要な伝達物質であるATPを測定し、その放出を制御するメカニズムをさらに調べることを可能にします。私たちの技術は、膀胱内腔から直接ATPを測定するため、培養細胞や膀胱組織を使用する技術よりも生理学的に関連性があります。手順を実演するのは、私の研究室の研究技術者であるKeara HealyとStephanie Daughertyです。
まず、動物を酸素中の4%〜5%イソフルランでガスを放出した密閉ボックスに入れることによって初期麻酔を誘発する。ウレタンを両側皮下投与し、次に動物をケージに入れて、ウレタンがほぼ2時間有効になるようにします。ウレタンが効くのを待った後、鉗子を使って動物の足をつまんで適切な麻酔面をテストします。
実験中の膨張に反応して膀胱の収縮を防ぐために、動物に神経節遮断剤であるヘキサメトニウムを注射します。.次に、実験中の乾燥を防ぐために、眼科用軟膏を動物の目に塗布します。次に、動物の腹部を剃り、正中線開腹術を行って膀胱を露出させます。
炎を使用して、短い長さのPE50イントラメディックチューブの一方の端をフレアし、チューブのもう一方の端に22ゲージの針を配置し、クレブス溶液で満たします。膀胱のドームの上に3-0絹縫合糸の小さなループを置き、小さな膀胱瘻造設術を行ってカテーテルのフレア端を挿入します。片手でカテーテルを持ちながら、縫合ループを締めて、もう一方の手でカテーテルを所定の位置に固定します。
縫合糸に2つの結び目を結び、カテーテルの固定を終了します。フレアヘッドが膀胱壁に接触するまでカテーテルを引き戻します。カテーテルを通して少量のクレブス溶液を注入することにより、漏れのセットアップをテストします。
IVカテーテルの端を外科用潤滑剤に浸します。一対の鉗子で外尿道口をそっと持ち、原稿に記載されているように、カテーテルの先端を尾の方向に尿道開口部に挿入します。カテーテルを90度回転させ、ゆっくりと前進させます。
ルアーロックハブが外尿道開口部から5ミリメートル離れるまでカテーテルを挿入します。カテーテルを固定し、外尿道口の周りに短い長さの3-0シルク縫合糸をループさせ、しっかりと結ぶことにより、カテーテルの周りの漏れを防ぎます。誤って引き抜かれないように、カテーテルをテープで尾に固定します。
カテーテル挿入したら、恥骨上膀胱カテーテルからクレブス溶液を膀胱に静かに注入し、液体が尿道カテーテルの周囲ではなく尿道カテーテルから流出することを確認します。3-0シルク縫合糸を使用して膀胱の腹部切開を閉じます。吸収性アンダーパッドを加熱パッドに配置して、体温を維持し、液体を吸収します。
動物を傾斜したボードに固定して、尿道カテーテルから膀胱内液を排出するのを助けてから、加熱パッドをオンにします。恥骨上カテーテルを、カテーテルをシリンジポンプと圧力トランスデューサに接続する三方ストップコックに接続します。圧力トランスデューサをアンプとデータ収集システムを介してコンピュータに接続します。
恥骨上カテーテルにクレブス溶液を毎分0.1ミリリットルの速度で注入し、液体を尿道カテーテルから1時間排出して、カテーテル移植中に放出された残留ATPを洗い流します。このウォッシュアウト期間の後、ルアーロックプラグを使用して尿道カテーテルにキャップをします。膀胱内の圧力を測定し、膀胱内圧が急激な上昇なしに30センチメートルの水圧までゆっくりと上昇し、膀胱収縮を示すのを探します。
膀胱の損傷を防ぐために、圧力が30センチメートルの水に達したら、尿道カテーテルからプラグを取り外します。膀胱を注入し、尿道カテーテルから溶離液を採取します。溶離液の100マイクロリットルアリコートをATPについてすぐにテストするか、後でバッチ定量するために凍結します。
管腔ATP濃度に対する膀胱膨満の影響をテストするには、尿道カテーテルをプラグでキャップし、膀胱圧を所望のレベルに達するまで監視してから、尿道カテーテルのキャップを外し、上記のようにATP測定または凍結用の溶離液を収集します。各膨張の後、追加のサンプルを採取する前に、膀胱を休ませて10〜15分間洗い流します。ATPの放出に対する薬物の効果をテストするには、膀胱を注入するクレブス溶液を、選択した薬物を含むクレブスに切り替えます。
効果を得るために10〜15分間薬を灌流し、前に示したように、膨張していない膀胱と膨張した膀胱からサンプルを収集します。100マイクロリットルの灌流液サンプルと50マイクロリットルのアッセイミックスをルミノメーターに入れて読み取ります。相対光単位からATP濃度に変換するには、クレブス溶液中のATPを1マイクロモルから10ピコモルの範囲で10倍希釈して標準曲線を作成し、ルミノメーターで読み取ります。
結果の読み取り値をグラフにプロットし、非線形回帰を実行して、動物から採取したサンプルから濃度を推定します。尿道カテーテルが詰まった状態で溶液を膀胱に注入すると、膀胱が収縮するにつれて膀胱内圧が急激に上昇します。ヘキサメトニウム投与後、膀胱内圧のより緩やかな上昇が観察され、収縮することなく30センチメートルの水まで圧力が上昇した。
ブリリアントブルーFCFは、検量線の傾きを有意に減少させ、サンプル中のATP濃度の計算値を変更するのに十分である。ブリリアントブルーFCFを含むクレブス標準を使用してサンプル中のATP濃度を計算すると、ATP濃度が50%過小評価される可能性があります膀胱の膨張は管腔ATP濃度を増加させ、NTPDaseアプラーゼの存在下で減少させるか、内因性NTPD ACEがARL67156で阻害されると増加する可能性があります。尿路上皮からの伸張誘発ATP放出を分析した。
膨張誘発ATP放出は、パネクチンチャネルアンタゴニスト、ブリリアントブルーFCF、およびカルボノキソロンによってブロックされますが、コネクソンチャネルアンタゴニストである18α-グリチルレチン酸ではブロックされません。ルシファールシフェラーゼ反応は多種多様な異なる薬剤による干渉の影響を非常に受けやすいため、すべてのルミノメーターの読み取り値を適切な標準曲線を使用してATPの濃度に変換することが不可欠です。私たちの技術は、膀胱の内腔内の任意の分子の膨張誘発放出を研究するために使用できます, その分子に適したアッセイが存在すると仮定します.
