Unser Protokoll misst ATP, einen wichtigen Übermittler in der Harnblase, der es uns ermöglicht, die Mechanismen, die seine Freisetzung steuern, weiter zu untersuchen. Unsere Technik misst ATP direkt aus dem Blasenlumen und ist damit physiologisch relevanter als Techniken, bei denen kultivierte Zellen oder Blasengewebe verwendet werden. Keara Healy und Stephanie Daugherty, Forschungstechniker in meinem Labor, werden das Verfahren demonstrieren.
Induzieren Sie zunächst eine Erstanästhesie, indem Sie das Tier in eine geschlossene Box legen, die mit 4% bis 5% Isofluran in Sauerstoff begast ist. Verabreichen Sie Urethan beidseitig subkutan und legen Sie das Tier dann in einen Käfig, damit das Urethan fast zwei Stunden lang wirken kann. Nachdem Sie darauf gewartet haben, dass das Urethan wirkt, testen Sie auf eine geeignete Anästhesieebene, indem Sie den Fuß des Tieres mit einer Pinzette einklemmen.
Um die Kontraktion der Blase als Reaktion auf Dehnung während des Versuchs zu verhindern, injizieren Sie dem Tier ein ganglionäres Blockermittel, Hexamethonium. Als nächstes tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen des Tieres auf, um ein Austrocknen während des Experiments zu verhindern. Rasieren Sie nun den Bauch des Tieres und führen Sie eine Mittellinien-Laparotomie durch, um die Harnblase freizulegen.
Flammen Sie mit einer Flamme ein Ende einer kurzen Länge des PE50-Intramedizinschlauchs auf, legen Sie eine 22-Gauge-Nadel in das andere Ende des Schlauchs und füllen Sie sie mit Krebslösung. Legen Sie eine kleine Schleife aus 3-0 Seidennaht über die Blasenkuppel und führen Sie eine kleine Zystostomie durch, um das ausgestellte Ende des Katheters einzuführen. Während Sie den Katheter mit einer Hand halten, ziehen Sie die Nahtschlaufe fest, um den Katheter mit der anderen Hand an Ort und Stelle zu halten.
Beenden Sie die Sicherung des Katheters, indem Sie zwei Knoten in der Naht binden. Ziehen Sie den Katheter zurück, bis der ausgestellte Kopf in Kontakt mit der Blasenwand ist. Testen Sie das Setup auf Lecks, indem Sie eine kleine Menge Krebslösung durch den Katheter injizieren.
Tauchen Sie das Ende eines intravenösen Katheters in chirurgisches Gleitmittel. Halten Sie den äußeren Meatus urethralis vorsichtig mit einer Pinzette und führen Sie die Spitze des Katheters in die Harnröhrenöffnung in Richtung des Schwanzes ein, wie im Manuskript beschrieben. Drehen Sie den Katheter um 90 Grad und bewegen Sie sich vorsichtig vorwärts.
Führen Sie den Katheter ein, bis die Luer-Lock-Nabe fünf Millimeter von der äußeren Harnröhrenöffnung entfernt ist. Sichern Sie den Katheter und verhindern Sie ein Auslaufen um den Katheter, indem Sie eine kurze 3-0-Seidennaht um den äußeren Harnröhrenfleisch schlingen und fest abbinden. Befestigen Sie den Katheter mit Klebeband am Schwanz, um zu verhindern, dass er versehentlich herausgezogen wird.
Nach der Katheterisierung wird die Krebslösung vorsichtig durch den suprapubischen Blasenkatheter in die Blase infundiert und bestätigt, dass die Flüssigkeit aus dem Harnröhrenkatheter und nicht um ihn herum fließt. Schließen Sie den Bauchschnitt über der Blase mit einer 3-0 Seidennaht. Legen Sie eine saugfähige Unterlage auf ein Heizkissen, um die Körperwärme zu halten und Flüssigkeit aufzunehmen.
Befestigen Sie das Tier auf dem geneigten Brett, um die intravesikale Flüssigkeit durch den Harnröhrenkatheter abzulassen, und schalten Sie dann das Heizkissen ein. Verbinden Sie den suprapubischen Katheter mit einem Dreiwege-Stopphahn, der den Katheter mit einer Spritzenpumpe und einem Druckaufnehmer verbindet. Schließen Sie den Druckmessumformer über einen Verstärker und ein Datenerfassungssystem an einen Computer an.
Infusion von Krebslösung durch den suprapubischen Katheter mit einer Geschwindigkeit von 0,1 Milliliter pro Minute und lassen Sie die Flüssigkeit eine Stunde lang durch den Harnröhrenkatheter abfließen, um das bei den Katheterimplantationen freigesetzte restliche ATP auszuwaschen. Nach dieser Auswaschphase verschließen Sie den Harnröhrenkatheter mit einem Luer-Lock-Stopfen. Messen Sie den Druck in der Blase und suchen Sie nach einem langsamen Anstieg des intravesikalen Drucks auf einen Druck von 30 Zentimetern Wasser ohne starken Druckanstieg, was auf eine Blasenkontraktion hinweist.
Entfernen Sie den Pfropfen aus dem Harnröhrenkatheter, wenn der Druck 30 Zentimeter Wasser erreicht, um eine Schädigung der Blase zu vermeiden. Infundieren Sie die Blase und sammeln Sie das Elutionsmittel aus dem Harnröhrenkatheter. Testen Sie 100 Mikroliter-Aliquots des Eluenten sofort auf ATP oder frieren Sie es für eine spätere Chargenquantifizierung ein.
Um die Wirkung der Blasendehnung auf luminale ATP-Konzentrationen zu testen, verschließen Sie den Harnröhrenkatheter mit dem Stöpsel und überwachen Sie den Blasendruck, bis er das gewünschte Niveau erreicht, lösen Sie dann den Harnröhrenkatheter und sammeln Sie das Elutionsmittel für die ATP-Messung oder das Einfrieren, wie oben beschrieben. Lassen Sie die Blase nach jeder Dehnung 10 bis 15 Minuten ruhen und auswaschen, bevor Sie weitere Proben entnehmen. Um die Wirkung von Medikamenten auf die Freisetzung von ATP zu testen, wechseln Sie die Krebslösung, die die Blase infundiert, auf Krebs, der das Medikament der Wahl enthält.
Perfundierten Sie das Medikament für 10 bis 15 Minuten, um eine Wirkung zu erzielen, und sammeln Sie dann die Proben aus nicht aufgeblähten und aufgeblähten Blasen, wie zuvor gezeigt. Geben Sie 100 Mikroliter Perfusatprobe mit 50 Mikrolitern der Assay-Mischung in das Luminometer zum Ablesen. Um von relativen leichten Einheiten in die ATP-Konzentration umzurechnen, machen Sie serielle Verdünnungen von ATP in Krebs-Lösung im Bereich von einem Mikromolar bis 10 Picomolar in zehnfachen Verdünnungen, um eine Standardkurve zu erstellen, und lesen Sie sie im Luminometer ab.
Zeichnen Sie die resultierenden Messwerte in einem Diagramm auf und führen Sie eine nichtlineare Regression durch, um die Konzentrationen aus den Proben des Tieres zu extrapolieren. Die Infusion der Lösung in die Blase, während der Harnröhrenkatheter verstopft ist, führt dazu, dass der intravesikale Druck stark ansteigt, wenn sich die Blase zusammenzieht. Nach der Verabreichung von Hexamethonium wurde ein allmählicher Anstieg des intravesikanischen Drucks beobachtet, so dass der Druck ohne Kontraktion auf bis zu 30 Zentimeter Wasser ansteigen konnte.
Brillantblau FCF verringert die Steigung der Standardkurve erheblich, was ausreicht, um die berechneten Werte für die ATP-Konzentration in der Probe zu ändern. Die Berechnung der ATP-Konzentration in einer Probe unter Verwendung des Krebs-Standards, der brillantblaues FCF enthält, kann zu einer Unterschätzung der ATP-Konzentration um 50% führen. Die Dehnung der Blase erhöht die luminalen ATP-Konzentrationen, die in Gegenwart von NTPDase-Apvrase verringert oder erhöht werden können, wenn endogene NTPD-ACEs mit ARL67156 gehemmt werden. Die dehnungsinduzierte ATP-Freisetzung aus dem Urothel wurde analysiert.
Die durch Dehnung hervorgerufene ATP-Freisetzung wird durch die Panectinkanal-Antagonisten, Brillantblau FCF und Carbonoxolon blockiert, nicht jedoch durch einen Connexon-Kanal-Antagonisten, 18-Alpha-Glycyrrhetinsäure. Es ist zwingend erforderlich, dass alle Luminometerwerte unter Verwendung der entsprechenden Standardkurve in ATP-Konzentrationen umgerechnet werden, da die Lucifer-Luciferase-Reaktion sehr anfällig für Störungen durch eine Vielzahl verschiedener Wirkstoffe ist. Unsere Technik könnte verwendet werden, um die durch Dehnung hervorgerufene Freisetzung eines Moleküls im Lumen der Blase zu untersuchen, vorausgesetzt, dass ein geeigneter Assay für dieses Molekül existiert.
