Protokolümüz, idrar kesesinde önemli bir verici olan ATP'yi ölçer ve bu da serbest bırakılmasını kontrol eden mekanizmaları daha fazla sorgulamamıza izin verir. Tekniğimiz ATP'yi doğrudan mesane lümeninden ölçerek, kültürlenmiş hücreleri veya mesane dokusunu kullanan tekniklerden daha fizyolojik olarak daha alakalı hale getirir. Prosedürü gösteren, laboratuvarımdaki araştırma teknisyenleri Keara Healy ve Stephanie Daugherty olacak.
Başlamak için, hayvanı oksijende% 4 ila% 5 izofluran ile gazlanmış kapalı bir kutuya yerleştirerek ilk anesteziyi indükleyin. Deri altından üretanı iki taraflı olarak uygulayın, ardından üretanın neredeyse iki saat boyunca etkili olmasına izin vermek için hayvanı bir kafese yerleştirin. Üretanın etkili olmasını bekledikten sonra, forseps kullanarak hayvanın ayağını sıkıştırarak uygun bir anestezi düzlemini test edin.
Deney sırasında distansiyona yanıt olarak mesanenin kasılmasını önlemek için, hayvana gangliyonik bloke edici bir ajan olan heksametonyum enjekte edin. Daha sonra, deney sırasında kurumayı önlemek için hayvanın gözlerine oftalmik merhem uygulayın. Şimdi hayvanın karnını tıraş edin ve idrar kesesini ortaya çıkarmak için orta hat laparotomi yapın.
Bir alev kullanarak, kısa bir PE50 intramedik borunun bir ucunu parlatın, borunun diğer ucuna 22 gauge'lik bir iğne yerleştirin ve Krebs çözeltisi ile doldurun. Mesanenin kubbesinin üzerine 3-0 ipek dikişten oluşan küçük bir halka yerleştirin ve kateterin alevli ucunu yerleştirmek için küçük bir sistostomi uygulayın. Kateteri bir elinizle tutarken, kateteri diğer elinizle yerine sabitlemek için dikiş halkasını sıkın.
Dikişe iki düğüm bağlayarak kateteri sabitlemeyi bitirin. Parlayan kafa mesane duvarıyla temas edene kadar kateteri geri çekin. Kateterden az miktarda Krebs çözeltisi enjekte ederek sızıntı için kurulumu test edin.
IV kateterin ucunu cerrahi kayganlaştırıcıya batırın. Dış üretral meatusu bir çift forseps ile nazikçe tutun ve kateterin ucunu üretral deliğe el yazmasında açıklandığı gibi kuyruk yönünde yerleştirin. Kateteri 90 derece döndürün ve yavaşça ilerleyin.
Kateteri, luer kilit göbeği dış üretral açıklıktan beş milimetre distal olana kadar yerleştirin. Kateteri sabitleyin ve dış üretral meatusun etrafına kısa bir 3-0 ipek sütür ilmek ilmek ilmek ilmek ve sıkıca bağlayarak kateterin etrafındaki sızıntıyı önleyin. Kateteri yanlışlıkla dışarı çekilmesini önlemek için kuyruğa bantla sabitleyin.
Kateterize edildikten sonra, Krebs çözeltisini suprapubik mesane kateteri yoluyla mesaneye nazikçe enjekte edin ve sıvının üretral kateterden dışarı aktığını ve etrafından akmadığını doğrulayın. Mesane üzerindeki karın kesisini 3-0 ipek dikiş kullanarak kapatın. Vücut ısısını korumak ve sıvıyı emmek için bir ısıtma yastığına emici bir alt ped yerleştirin.
İntravezikal sıvının üretral kateterden boşaltılmasına yardımcı olmak için hayvanı eğimli tahtaya sabitleyin, ardından ısıtma yastığını açın. Suprapubik kateteri, kateteri bir şırınga pompasına ve bir basınç dönüştürücüsüne bağlayan üç yönlü bir durdurma horozuna bağlayın. Basınç dönüştürücüsünü bir amplifikatör ve bir veri toplama sistemi aracılığıyla bir bilgisayara bağlayın.
Krebs çözeltisini suprapubik kateterden dakikada 0.1 mililitre oranında infüze edin ve kateter implantasyonları sırasında salınan artık ATP'yi yıkamak için sıvının bir saat boyunca üretral kateterden akmasına izin verin. Bu yıkama süresinden sonra, üretral kateteri bir luer kilit tapası kullanarak kapatın. Mesanedeki basıncı ölçün ve intravezikal basınçta, basınçta keskin bir artış olmadan 30 santimetre su basıncına yavaş bir artış olup olmadığına bakın, bu da mesane kasılmasını gösterir.
Mesanenin zarar görmesini önlemek için basınç 30 santimetre suya ulaştığında tıkacı üretral kateterden çıkarın. Mesaneyi infüze edin ve üretral kateterden elüenti toplayın. Eletentin 100 mikrolitrelik alikotlarını ATP için hemen test edin veya daha sonraki parti miktarı için dondurun.
Mesane distansiyonunun luminal ATP konsantrasyonları üzerindeki etkisini test etmek için, üretral kateteri tıkaç ile kapatın ve istenen seviyeye ulaşana kadar mesane basıncını izleyin, ardından üretral kateterin kapağını açın ve yukarıda açıklandığı gibi ATP ölçümü veya donma için elüenti toplayın. Her distansiyondan sonra, ek örnekler almadan önce mesanenin dinlenmesine ve 10 ila 15 dakika yıkanmasına izin verin. İlaçların ATP salınımı üzerindeki etkisini test etmek için, mesaneyi infüze eden Krebs çözeltisini, seçilen ilacı içeren Krebs'e geçirin.
Bir etkiye sahip olmak için ilacı 10 ila 15 dakika boyunca perfüze edin ve daha sonra daha önce gösterildiği gibi, şişkin olmayan ve şişmiş mesanelerden örnekleri toplayın. Okumak için luminometreye 50 mikrolitre tahlil karışımı ile 100 mikrolitre perfüzyonat örneği yerleştirin. Göreceli ışık birimlerinden ATP konsantrasyonuna dönüştürmek için, standart bir eğri oluşturmak için Krebs çözeltisinde ATP'nin on kat seyreltmede bir mikromolar ila 10 pikomolar arasında değişen seri seyreltmelerini yapın ve bunları luminometrede okuyun.
Elde edilen okumaları bir grafik üzerinde çizin ve hayvandan alınan örneklerden konsantrasyonları tahmin etmek için doğrusal olmayan bir regresyon gerçekleştirin. Üretral kateter tıkanırken çözeltinin mesaneye infüzyonu, mesane kasıldıkça intravezikal basıncın keskin bir şekilde yükselmesine neden olur. Heksametonyum uygulamasından sonra, intravezikal basınçta daha kademeli bir artış gözlendi ve basıncın büzülmeden 30 santimetre suya kadar yükselmesine izin verildi.
Parlak mavi FCF, numunedeki ATP konsantrasyonu için hesaplanan değerleri değiştirmeye yetecek kadar standart eğrinin eğimini önemli ölçüde azaltır. Parlak mavi FCF içeren Krebs standardını kullanarak bir numunedeki ATP konsantrasyonunun hesaplanması, ATP konsantrasyonunun% 50 oranında hafife alınmasına neden olabilir, mesanenin distansiyonu, NTPDaz apvraz varlığında azaltılabilen veya endojen NTPD ACE'ler ARL67156 ile inhibe edildiğinde artabilen luminal ATP konsantrasyonlarını arttırır. Ürotelyumdan gerilmeye bağlı ATP salınımı analiz edildi.
Distansiyonla uyarılan ATP salınımı panektin kanal antagonistleri, parlak mavi FCF ve karbonoksolon tarafından bloke edilir, ancak bir konnekson kanal antagonisti olan 18 alfa-glisiretinik asit ile bloke edilmez. Lucifer Luciferaz reaksiyonu, çok çeşitli farklı ajanların müdahalesine karşı oldukça hassas olduğundan, tüm luminometre okumalarının uygun standart eğri kullanılarak ATP konsantrasyonlarına dönüştürülmesi zorunludur. Tekniğimiz, mesanenin lümenindeki herhangi bir molekülün distansiyon ile uyarılmış salınımını incelemek için kullanılabilir, bu molekül için uygun bir tahlilin mevcut olduğu varsayılarak.
