הפרוטוקול שלנו מודד ATP, משדר חשוב בשלפוחית השתן, שיאפשר לנו להמשיך לחקור את המנגנונים השולטים בשחרורו. הטכניקה שלנו מודדת ATP ישירות מלומן שלפוחית השתן, מה שהופך אותו לרלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית מאשר טכניקות המשתמשות בתאים בתרבית או ברקמת שלפוחית השתן. מי שידגימו את ההליך יהיו קיארה הילי וסטפני דוהרטי, טכנאיות מחקר במעבדה שלי.
כדי להתחיל, יש להשרות הרדמה ראשונית על ידי הנחת בעל החיים בקופסה סגורה עם 4% עד 5% איזופלורן בחמצן. מתן תת עורי של האורתן דו-צדדי, ולאחר מכן הכנס את בעל החיים לכלוב כדי לאפשר לשופכן להיכנס לתוקף במשך כמעט שעתיים. לאחר ההמתנה לכניסת השופכן לתוקף, יש לבדוק מישור הרדמה תקין על ידי צביטת כף רגלו של בעל החיים באמצעות מלקחיים.
כדי למנוע את התכווצות שלפוחית השתן בתגובה להתנפחות במהלך הניסוי, הזריקו לחיה חומר חוסם גנגליוני, הקסמטוניום. לאחר מכן, יש למרוח משחת עיניים על עיני החיה כדי למנוע התייבשות במהלך הניסוי. כעת יש לגלח את בטנו של בעל החיים ולבצע לפרוטומיה בקו האמצע כדי לחשוף את שלפוחית השתן.
באמצעות להבה, יש להדליק קצה אחד של צינור PE50 באורך קצר, להכניס מחט באורך 22 לקצה השני של הצינור ולמלא אותו בתמיסת קרבס. מניחים לולאה קטנה של תפר משי 3-0 מעל כיפת שלפוחית השתן ומבצעים ציסטסטומיה קטנה להחדרת הקצה המתלקח של הצנתר. תוך כדי החזקת הצנתר ביד אחת, הדקו את לולאת התפר כדי לאבטח את הצנתר במקומו ביד השנייה.
לסיים את אבטחת הצנתר על ידי קשירת שני קשרים בתפר. משוך את הצנתר לאחור עד שהראש המתלקח בא במגע עם דופן שלפוחית השתן. בדוק את ההתקנה עבור דליפות על ידי החדרת כמות קטנה של תמיסת קרבס דרך הצנתר.
יש לטבול את קצה הצנתר בעירוי בחומר סיכה כירורגי. החזיקו את בשר השופכה החיצוני בעדינות בעזרת זוג מלקחיים, והכניסו את קצה הצנתר לפתח השופכה לכיוון הזנב, כמתואר בכתב היד. סובבו את הצנתר ב-90 מעלות והתקדמו בעדינות.
הכנס את הצנתר עד שרכזת נעילת הפיתוי תהיה דיסטלית של חמישה מילימטרים מפתח השופכה החיצוני. אבטחו את הצנתר ומנעו דליפה סביב הצנתר על ידי לולאת אורך קצר של תפר משי 3-0 סביב בשר השופכה החיצוני וקשירתו בחוזקה. הצמידו את הצנתר לזנב בעזרת נייר דבק כדי למנוע ממנו להישלף בטעות.
לאחר הצנתור, יש להחדיר בעדינות תמיסת קרבס לשלפוחית השתן דרך צנתר שלפוחית השתן הסופרפובי, ולאשר שהנוזל זורם החוצה מצנתר השופכה ולא סביבו. סגור את חתך הבטן מעל שלפוחית השתן באמצעות תפר משי 3-0. הניחו כרית תחתונה סופגת על כרית חימום כדי לשמור על חום הגוף ולספוג נוזלים.
אבטחו את בעל החיים על הלוח המשופע כדי לסייע בניקוז נוזל תוך שלפוחית דרך צנתר השופכה, ואז הפעילו את כרית החימום. חבר את הצנתר העל-כיווני לזין עצירה תלת-כיווני המחבר את הצנתר למשאבת מזרק ומתמר לחץ. חבר את מתמר הלחץ למחשב באמצעות מגבר ומערכת קליטת נתונים.
יש להחדיר תמיסת קרבס דרך הצנתר הסופרפובי בקצב של 0.1 מיליליטר לדקה, ולאפשר לנוזל להתנקז דרך צנתר השופכה למשך שעה כדי לשטוף את שאריות ה-ATP שהשתחררו במהלך השתלות הצנתר. לאחר תקופת שטיפה זו, יש לסגור את צנתר השופכה באמצעות פקק נעילת פתימה. למדוד את הלחץ בשלפוחית השתן ולחפש עלייה איטית בלחץ תוך שלפוחית ללחץ של 30 ס"מ מים ללא עלייה חדה בלחץ, המעידה על התכווצות שלפוחית השתן.
הסר את התקע מקטטר השופכה כאשר הלחץ מגיע למים של 30 ס"מ כדי למנוע נזק לשלפוחית השתן. להחדיר את שלפוחית השתן ולאסוף את eluent מן קטטר השופכה. בדוק 100 microliter aliquots של eluent מיד עבור ATP או להקפיא לכימות אצווה מאוחר יותר.
כדי לבדוק את ההשפעה של התנפחות שלפוחית השתן על ריכוזי ATP לומינליים, יש לסגור את צנתר השופכה עם התקע ולנטר את לחץ השלפוחית עד שהוא מגיע לרמה הרצויה, ולאחר מכן לפתוח את מכסה צנתר השופכה ולאסוף את הלואנט למדידה או הקפאה של ATP, כמתואר לעיל. לאחר כל התנפחות יש לאפשר לשלפוחית השתן לנוח ולשטוף אותה למשך 10 עד 15 דקות לפני נטילת דגימות נוספות. כדי לבדוק את השפעת התרופות על שחרור ATP, החליפו את תמיסת קרבס המחדירה את שלפוחית השתן לקרבס המכילה את תרופת הבחירה.
יש לערבב את התרופה למשך 10 עד 15 דקות כדי להשפיע, ולאחר מכן לאסוף את הדגימות משלפוחית השתן הלא נפוחה והנפוחה, כפי שהודגם קודם לכן. מניחים דגימה של 100 מיקרוליטר של פרפוזט עם 50 מיקרוליטר של תערובת הבדיקה בלומינומטר לקריאה. כדי להמיר מיחידות אור יחסיות לריכוז ATP, בצע דילולים סדרתיים של ATP בתמיסת קרבס החל ממיקרומולר אחד ועד 10 פיקומולרי בדילול פי עשרה כדי ליצור עקומה סטנדרטית, וקרא אותם בלומינומטר.
שרטט את הקריאות המתקבלות על גרף ובצע רגרסיה לא ליניארית כדי להסיק ריכוזים מהדגימות שנלקחו מהחיה. עירוי התמיסה לשלפוחית השתן בזמן שקטטר השופכה מחובר גורם ללחץ תוך שלפוחית לעלות בחדות ככל ששלפוחית השתן מתכווצת. לאחר מתן hexamethonium נצפתה עלייה הדרגתית יותר בלחץ תוך שלפוחית, המאפשרת ללחץ לעלות עד 30 ס"מ מים ללא התכווצות.
FCF כחול מבריק מקטין באופן משמעותי את שיפוע העקומה הסטנדרטית, מספיק כדי לשנות את הערכים המחושבים עבור ריכוז ATP במדגם. חישוב ריכוז ה-ATP בדגימה באמצעות תקן קרבס המכיל FCF כחול מבריק יכול לגרום להערכת חסר של ריכוז ה-ATP ב-50% התנפחות שלפוחית השתן מעלה את ריכוזי ה-ATP הלומינליים, אשר יכולים להיות מופחתים בנוכחות NTPDase apvrase, או לעלות כאשר מעכבים NTPD ACE אנדוגניים עם ARL67156. שחרור ATP המושרה על ידי מתיחה מן השתן נותח.
שחרור ATP מעורר התנפחות נחסם על ידי אנטגוניסטים של תעלת פנקטין, FCF כחול מבריק וקרבונוקסולון, אך לא עם אנטגוניסט ערוץ קונקסון, 18 חומצה אלפא-גליצירטינית. זה הכרחי שכל קריאות הלומינומטר יומרו לריכוזים של ATP באמצעות העקומה הסטנדרטית המתאימה, מכיוון שתגובת לוציפר לוציפראז רגישה מאוד להפרעות על ידי מגוון רחב של סוכנים שונים. הטכניקה שלנו יכולה לשמש לחקר השחרור מעורר התנפחות של כל מולקולה בלומן של שלפוחית השתן, בהנחה שקיימת בדיקה מתאימה למולקולה זו.
