Il nostro protocollo misura l'ATP, un importante trasmettitore nella vescica urinaria, che ci permetterà di interrogare ulteriormente i meccanismi che ne controllano il rilascio. La nostra tecnica misura l'ATP direttamente dal lume della vescica, rendendolo più fisiologicamente rilevante rispetto alle tecniche che utilizzano cellule in coltura o tessuto vescicale A dimostrare la procedura saranno Keara Healy e Stephanie Daugherty, tecnici di ricerca nel mio laboratorio.
Per iniziare, indurre l'anestesia iniziale mettendo l'animale in una scatola chiusa gassata con isoflurano dal 4% al 5% in ossigeno. Somministrare per via sottocutanea l'uretano bilateralmente, quindi mettere l'animale in una gabbia per consentire all'uretano di avere effetto per quasi due ore. Dopo aver atteso che l'uretano abbia effetto, testare un piano adeguato di anestesia pizzicando il piede dell'animale usando una pinza.
Per prevenire la contrazione della vescica in risposta alla distensione durante l'esperimento, iniettare l'animale con un agente bloccante gangliare, l'esametonio. Quindi, applicare un unguento oftalmico agli occhi dell'animale per prevenire l'essiccazione durante l'esperimento. Ora radere l'addome dell'animale ed eseguire una laparotomia della linea mediana per esporre la vescica urinaria.
Usando una fiamma, bruciare un'estremità di un tubo intramedico PE50 di breve lunghezza, posizionare un ago calibro 22 nell'altra estremità del tubo e riempirlo con la soluzione di Krebs. Posizionare un piccolo anello di sutura di seta 3-0 sulla cupola della vescica ed eseguire una piccola cistostomia per inserire l'estremità svasata del catetere. Tenendo il catetere con una mano, stringere l'anello di sutura per fissare il catetere in posizione con l'altra mano.
Terminare il fissaggio del catetere legando due nodi nella sutura. Tirare indietro il catetere fino a quando la testa svasata è in contatto con la parete della vescica. Testare la configurazione per le perdite infondendo una piccola quantità di soluzione di Krebs attraverso il catetere.
Immergere l'estremità di un catetere IV nel lubrificante chirurgico. Tenere delicatamente il meato uretrale esterno con un paio di pinze e inserire la punta del catetere nell'orifizio uretrale nella direzione della coda, come descritto nel manoscritto. Ruotare il catetere di 90 gradi e avanzare delicatamente.
Inserire il catetere fino a quando il mozzo luer lock è distale di cinque millimetri dall'apertura uretrale esterna. Fissare il catetere e prevenire perdite intorno al catetere avvolgendo una breve lunghezza di sutura di seta 3-0 attorno al meato uretrale esterno e legandolo saldamente. Fissare il catetere alla coda con del nastro adesivo per evitare che venga estratto accidentalmente.
Una volta cateterizzato, infondere delicatamente la soluzione di Krebs nella vescica attraverso il catetere vescica sovrapubica e confermare che il fluido fuoriesce dal catetere uretrale e non intorno ad esso. Chiudere l'incisione addominale sopra la vescica usando una sutura di seta 3-0. Posizionare un sottopad assorbente su una piastra riscaldante per mantenere il calore corporeo e assorbire il liquido.
Fissare l'animale sulla tavola inclinata per aiutare a drenare il liquido intravescicale attraverso il catetere uretrale, quindi accendere la piastra riscaldante. Collegare il catetere sovrapubico a un rubinetto di arresto a tre vie che collega il catetere a una pompa a siringa e un trasduttore di pressione. Collegare il trasduttore di pressione a un computer tramite un amplificatore e un sistema di acquisizione dati.
Infondere la soluzione di Krebs attraverso il catetere sovrapubico ad una velocità di 0,1 millilitri al minuto e lasciare che il fluido defluisca attraverso il catetere uretrale per un'ora per lavare qualsiasi ATP residuo rilasciato durante gli impianti del catetere. Dopo questo periodo di washout, tappare il catetere uretrale usando un tappo luer lock. Misurare la pressione nella vescica e cercare un lento aumento della pressione intravescicale a una pressione di 30 centimetri d'acqua senza un forte aumento della pressione, indicando una contrazione della vescica.
Rimuovere il tappo dal catetere uretrale quando la pressione raggiunge i 30 centimetri d'acqua per evitare danni alla vescica. Infondere la vescica e raccogliere l'eluente dal catetere uretrale. Testare immediatamente 100 microlitri di aliquote dell'eluente per l'ATP o congelare per la successiva quantificazione del lotto.
Per testare l'effetto della distensione della vescica sulle concentrazioni luminali di ATP, tappare il catetere uretrale con il tappo e monitorare la pressione della vescica fino a raggiungere il livello desiderato, quindi aprire il catetere uretrale e raccogliere l'eluente per la misurazione o il congelamento dell'ATP, come descritto sopra. Dopo ogni distensione, lasciare riposare la vescica e lavarsi per 10-15 minuti prima di prelevare ulteriori campioni. Per testare l'effetto dei farmaci sul rilascio di ATP, cambiare la soluzione di Krebs che infonde la vescica a Krebs contenente il farmaco di scelta.
Perfondere il farmaco per 10-15 minuti per avere un effetto, quindi raccogliere i campioni da vesciche non distese e distese, come dimostrato in precedenza. Posizionare un campione di 100 microlitri di perfulato con 50 microlitri della miscela di dosaggio nel luminometro per la lettura. Per convertire da unità di luce relativa alla concentrazione di ATP, effettuare diluizioni seriali di ATP in soluzione di Krebs che vanno da un micromolare a 10 picomolar in diluizioni di dieci volte per creare una curva standard e leggerle nel luminometro.
Tracciare le letture risultanti su un grafico ed eseguire una regressione non lineare per estrapolare le concentrazioni dai campioni prelevati dall'animale. L'infusione della soluzione nella vescica mentre il catetere uretrale è tappato fa aumentare bruscamente la pressione intravescicale mentre la vescica si contrae. Dopo la somministrazione di esametonio, è stato osservato un aumento più graduale della pressione intravescicale, consentendo alla pressione di salire fino a 30 centimetri di acqua senza contrazione.
Il blu brillante FCF diminuisce significativamente la pendenza della curva standard, sufficiente a modificare i valori calcolati per la concentrazione di ATP nel campione. Il calcolo della concentrazione di ATP in un campione utilizzando lo standard di Krebs contenente FCF blu brillante può comportare una sottostima della concentrazione di ATP del 50%La distensione della vescica aumenta le concentrazioni luminali di ATP, che possono essere diminuite in presenza di apvrasi NTPDasi, o aumentate quando gli ACE NTPD endogeni sono inibiti con ARL67156. È stato analizzato il rilascio di ATP indotto dallo stiramento dall'urotelio.
Il rilascio di ATP evocato dalla distensione è bloccato dagli antagonisti del canale della panectina, FCF blu brillante e carbonoxolone, ma non con un antagonista del canale della connessione, l'acido 18 alfa-glicirretico. È imperativo che tutte le letture del luminometro siano convertite in concentrazioni di ATP utilizzando la curva standard appropriata, poiché la reazione lucifera luciferasiche è altamente suscettibile alle interferenze di un'ampia varietà di agenti diversi. La nostra tecnica potrebbe essere utilizzata per studiare il rilascio evocato dalla distensione di qualsiasi molecola nel lume della vescica, supponendo che esista un saggio adatto per quella molecola.
