Nosso protocolo mede o ATP, um importante transmissor na bexiga urinária, o que nos permitirá interrogar ainda mais os mecanismos que controlam sua liberação. Nossa técnica mede o ATP diretamente do lúmen da bexiga, tornando-o mais fisiologicamente relevante do que as técnicas que usam células cultivadas ou tecido vesical. Demonstrando o procedimento estarão Keara Healy e Stephanie Daugherty, técnicas de pesquisa no meu laboratório.
Para começar, induzir a anestesia inicial colocando o animal em uma caixa fechada gaseificada com isoflurano de 4% a 5% em oxigênio. Por via subcutânea, administre uretano bilateralmente e, em seguida, coloque o animal em uma gaiola para permitir que o uretano faça efeito por quase duas horas. Depois de esperar que o uretano faça efeito, teste um plano adequado de anestesia apertando o pé do animal usando fórceps.
Para evitar a contração da bexiga em resposta à distensão durante o experimento, injete no animal um agente bloqueador ganglionar, o hexametônio. Em seguida, aplique pomada oftálmica nos olhos do animal para evitar a secagem durante o experimento. Agora raspe o abdômen do animal e realize uma laparotomia na linha média para expor a bexiga urinária.
Usando uma chama, acender uma extremidade de um comprimento curto de tubo intramédico PE50, colocar uma agulha de calibre 22 na outra extremidade da tubulação e enchê-la com solução de Krebs. Coloque uma pequena alça de sutura de seda 3-0 sobre a cúpula da bexiga e realize uma pequena cistostomia para inserir a extremidade inflamada do cateter. Ao segurar o cateter com uma mão, aperte a alça de sutura para prender o cateter no lugar com a outra mão.
Termine de prender o cateter amarrando dois nós na sutura. Puxe o cateter para trás até que a cabeça inflamada esteja em contato com a parede da bexiga. Teste a configuração para vazamentos infundindo uma pequena quantidade de solução de Krebs através do cateter.
Mergulhe a extremidade de um cateter IV em lubrificante cirúrgico. Segure o meato uretral externo suavemente com um par de pinças e insira a ponta do cateter no orifício uretral na direção da cauda, conforme descrito no manuscrito. Gire o cateter 90 graus e avance suavemente.
Insira o cateter até que o cubo de luer lock esteja a cinco milímetros da abertura uretral externa. Prenda o cateter e evite o vazamento ao redor do cateter enrolando um curto comprimento de sutura de seda 3-0 ao redor do meato uretral externo e amarrando-o com força. Prenda o cateter à cauda com fita adesiva para evitar que ele seja acidentalmente retirado.
Uma vez cateterizado, infundir suavemente a solução de Krebs na bexiga através do cateter da bexiga suprapúbica e confirmar que o fluido flui para fora do cateter uretral e não em torno dele. Feche a incisão abdominal sobre a bexiga usando uma sutura de seda 3-0. Coloque uma parte inferior absorvente em uma almofada de aquecimento para manter o calor do corpo e absorver o fluido.
Prenda o animal na placa inclinada para ajudar na drenagem do fluido intravesical através do cateter uretral e, em seguida, ligue a almofada de aquecimento. Conecte o cateter suprapúbico a uma torneira de parada de três vias conectando o cateter a uma bomba de seringa e a um transdutor de pressão. Conecte o transdutor de pressão a um computador através de um amplificador e um sistema de aquisição de dados.
Infundir a solução de Krebs através do cateter suprapúbico a uma taxa de 0,1 mililitros por minuto e permitir que o fluido escorra através do cateter uretral por uma hora para lavar qualquer ATP residual liberado durante as implantações do cateter. Após este período de lavagem, tampe o cateter uretral usando um plugue luer lock. Meça a pressão na bexiga e procure um aumento lento da pressão intravesical para uma pressão de 30 centímetros de água sem um aumento acentuado da pressão, indicando uma contração da bexiga.
Remova o plugue do cateter uretral quando a pressão atingir 30 centímetros de água para evitar danos à bexiga. Infundir a bexiga e coletar o eluente do cateter uretral. Testar alíquotas de 100 microlitros do eluente imediatamente para ATP ou congelar para quantificação posterior do lote.
Para testar o efeito da distensão da bexiga nas concentrações luminais de ATP, tampe o cateter uretral com o plugue e monitore a pressão da bexiga até atingir o nível desejado, em seguida, destampe o cateter uretral e colete o eluente para medição ou congelamento de ATP, conforme descrito acima. Após cada distensão, deixe a bexiga descansar e lavar por 10 a 15 minutos antes de coletar amostras adicionais. Para testar o efeito das drogas na liberação de ATP, mude a solução de Krebs que infunde a bexiga para Krebs contendo a droga de escolha.
Perfundir a droga por 10 a 15 minutos para ter um efeito e, em seguida, coletar as amostras de bexigas não distendidas e distendidas, como demonstrado anteriormente. Coloque 100 microlitros de amostra de perfusato com 50 microlitros da mistura de ensaio no luminômetro para leitura. Para converter de unidades de luz relativas para a concentração de ATP, faça diluições seriais de ATP em solução de Krebs variando de um micromolar a 10 picomolares em diluições de dez vezes para criar uma curva padrão e leia-as no luminômetro.
Plotar as leituras resultantes em um gráfico e realizar uma regressão não linear para extrapolar as concentrações das amostras retiradas do animal. A infusão da solução na bexiga enquanto o cateter uretral está entupido faz com que a pressão intravesical aumente acentuadamente à medida que a bexiga se contrai. Após a administração de hexametônio, observou-se um aumento mais gradual da pressão intravesical, permitindo que a pressão subisse até 30 centímetros de água sem contração.
O FCF azul brilhante diminui significativamente a inclinação da curva padrão, suficiente para alterar os valores calculados para a concentração de ATP na amostra. O cálculo da concentração de ATP em uma amostra usando o padrão de Krebs contendo FCF azul brilhante pode resultar em uma subestimação da concentração de ATP em 50%A distensão da bexiga aumenta as concentrações luminais de ATP, que podem ser diminuídas na presença de NTPDase apvrase ou aumentadas quando as ECA NTPD endógenas são inibidas com ARL67156. A liberação de ATP induzida por estiramento do urotélio foi analisada.
A liberação de ATP evocada por distensão é bloqueada pelos antagonistas do canal de panectina, FCF azul brilhante e carbonoxolona, mas não com um antagonista do canal de conexônio, ácido alfa-glicirretínico 18. É imperativo que todas as leituras do luminômetro sejam convertidas em concentrações de ATP usando a curva padrão apropriada, pois a reação da Lucifer Luciferase é altamente suscetível à interferência de uma ampla variedade de agentes diferentes. Nossa técnica poderia ser usada para estudar a liberação evocada por distensão de qualquer molécula no lúmen da bexiga, assumindo que existe um ensaio adequado para essa molécula.
