إن الإنشاء الناجح لنموذج الفأر غير القادر ASCJ يمتد إلى نموذج حيواني بسيط لعدم قدرة الكاحل ، ويوفر مفاهيم جديدة لدراسة أمراض القدم السريرية. لقد أنشأنا نموذجا حيوانيا أكثر انسجاما مع الوضع السريري الفعلي ، والذي يمكن استخدامه لمزيد من البحث حول تشخيص وعلاج أمراض القدم. قبل أسبوع واحد من التجربة ، قم بإخضاع الفئران لموازنة شعاع وتدريب المشي ، والانتقال من أحد طرفي عارضة التوازن أو الأنبوب على شكل حرف U إلى الطرف الآخر ، دون توقف.
بعد تخدير وإزالة الشعر على مفصل الكاحل للأطراف الخلفية اليمنى للفأر ، قم بتطهير الجلد المكشوف بمسحة اليود. انقل الفأر إلى غرفة عمليات المجهرية باستخدام وسادة جراحية معقمة. بالنسبة لمجموعات الرباط العنقي العرضي والرباط الأمامي ، قم بعمل شق طولي مائل لأسفل بطول سبعة ملليمترات مع مشرط على الجلد فوق مفصل الكاحل الأيمن.
والتحقيق مع ملقط مستقيم المجهرية في الجزء الأمامي من مفصل الكاحل. ضمان تعرض الرباط الأمامي للفكي عند الحد السفلي لجسم الكاحل والشظية ، قم بقصه برفق بمشرط. افصل بين الأوتار الشظوية الطويلة والقصيرة ، والأوتار الطويلة الباسطة.
فضح الرباط العنقي ، وقطعه بمشرط. بالنسبة للرباط العنقي المستعرض بالإضافة إلى مجموعة الرباط الدالي ، قم بعمل شق عمودي بطول ثمانية ملليمترات على الجلد الإنسي لمفصل الكاحل الأيمن ، وافصل DL بصراحة عن المليولوس الإنسي لقطعه. ثم قطع الرباط العنقي كما هو موضح سابقا.
بالنسبة للمجموعة الوهمية ، قم بإجراء جراحة وهمية على مفصل الكاحل الأيمن. بعد شطف الشق بمحلول ملحي طبيعي معقم ، قم بخياطته بخيط نايلون جراحي 5-0 ، متبوعا بتطهير الشق المخيط بمسحة اليود. بمجرد انخفاض تورم مفصل الزاوية بعد أسبوعين من الجراحة ، قم بتمرين الفئران في آلة التعب الدوار للفأر لمدة ساعة واحدة كل يوم.
لاختبار عارضة التوازن، قم بتثبيت شعاع خشبي دائري يميل عند 15 درجة في أحد طرفيه باستخدام مشبك ترايبود للتصوير الفوتوغرافي، وضع الطرف الآخر على سطح عمل متصل بشريط كاسيت مغلق. قم بإجراء تدريب شعاع التوازن قبل أسبوع واحد من الجراحة للتأكد من أن الفئران تتحرك بسلاسة من أحد طرفي الحزمة إلى الطرف الآخر. ضع في اعتبارك أن الفأر قد اجتاز الاختبار عندما يمر عبر الحزمة مرتين في 60 ثانية دون توقف.
بعد كل تجربة ، قم برش عارضة التوازن بنسبة 75٪ كحول لتقديم الرائحة المتبقية للفأر السابق من التأثير على الماوس التالي. قم بإجراء اختبار عارضة التوازن وسجل متوسط الوقت لكل ماوس يمر بعارضة التوازن مرتين على التوالي. وعدد المرات التي تنزلق فيها القدم الخلفية اليمنى من الحزمة ، كمتغيرات تابعة.
لتحليل البصمة ، ضع قناة بلاستيكية على شكل حرف U على الطاولة التجريبية ، وقم بتوصيل أحد طرفي القناة البلاستيكية بشريط كاسيت مغلق. ضع ورقة صبغية عادية مسطحة في القناة. ثم أمسك الماوس بكلتا يديه ، وقم بطلاء القدمين الأمامية والخلفية بالتساوي باستخدام صبغة حمراء وخضراء غير سامة.
الآن ، ضع الماوس المطلي في أحد طرفي القناة ، واتركه ينتقل إلى الطرف الآخر من الكاسيت. خذ الورق المصطبغ مع آثار الأقدام ، وقم بتمييزه ، واتركه يجف في مكان جيد التهوية ومظلل. رش القناة البلاستيكية على شكل حرف U بنسبة 75٪ كحول بعد مرور كل فأر ، لمنع الرائحة المتبقية للفأر السابق من التأثير على الماوس التالي.
حدد ثلاث آثار ماوس واضحة متتالية على كل ورقة. باستخدام المسطرة ، قم بقياس طول خطوة بصمة القدم اليمنى للماوس ، مع عرض الخطوة بين آثار الأقدام اليمنى واليسرى. استخدم ملاقط ومقص مجهري لإزالة الأنسجة الرخوة الزائدة حول عينات الكاحل.
وبعد ذلك ، ضع العينات في أنبوب طرد مركزي يحتوي على محلول إزالة الكلس EDTA بنسبة 10٪ ، وقم بتمييز المجموعات المختلفة. بعد ذلك ، ضع أنبوب الطرد المركزي على طاولة اهتزاز لإزالة الكلس. قم بتغيير محلول إزالة الكلس مرة واحدة يوميا ، وحدد إزالة الكلس من العينات.
بعد شهر واحد من إزالة الكلس ، قم بتجفيف العينات بالكحول المتدرج ، ثم استخدم N-butanol لمدة ثماني ساعات لأغراض التطهير. أخيرا ، اغمر العينات التي تم تطهيرها في البارافين في وضع إكليلي للتضمين. قبل التقسيم ، انقل العينات من الثلاجة ذات الأربع درجات مئوية إلى مجمد بدرجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة 10 دقائق تقريبا ، لتسهيل قطع الطائرات بالكامل.
إصلاح العينات على microtome وتقسيمها بسمك ستة ميكرومتر. في الوقت نفسه ، استخدم المجهر لمراقبة ما إذا كانت العينات قد تم قطعها بالمستوى المتوقع لسهولة اختراق إبرة حقنة في الأنسجة العظمية. بعد قطع قسمين أو ثلاثة أقسام كاملة من البارافين على التوالي ، قم بنقلها إلى الجهاز اللوحي ، على 40 درجة مئوية ، للتوسع الكامل.
ثم قم بإزالة أقسام البارافين بشريحة زجاجية. أخيرا ، قم بتمييز الشرائح بالمجموعات والأرقام. لمراقبة هيكل مفصل ASCJ السليم تحت المجهر.
ضع الأقسام في حاضنة على 60 درجة مئوية لمدة 40 إلى 50 دقيقة. ثم قم بإزالة الشمع من المقاطع باستخدام الزيلين ثلاث مرات ، كما هو موضح في المخطوطة. ضع المقاطع منزوعة الشمع في 100٪ إيثانول مرتين لمدة ثلاث دقائق ، تليها 90٪ و 80٪ إيثانول لمدة خمس دقائق لكل منهما.
ثم اغسل الأقسام بالماء المقطر المزدوج لمدة خمس دقائق. بعد النقع في الهيماتوكسيلين لمدة دقيقة واحدة ، اغسل الأقسام بالماء المقطر المزدوج حتى تصبح عديمة اللون. انقع الأقسام في محلول تمايز الإيثانول الحمضي بنسبة 1٪ لمدة 30 ثانية ، واغسلها بالماء المقطر المزدوج.
بمجرد تلطيخ الأقسام بمحلول الأمونيا بنسبة 1٪ ، وغسلها بالماء المقطر المزدوج ، قم بتلطيخ العينات بمحلول تلطيخ eosin لمدة دقيقة واحدة. ثم ضعهم في 95٪ و 100٪ إيثانول على التوالي لمدة دقيقة واحدة لكل منهما. أخيرا ، عالج الأقسام بالزيلين أربعة لمدة دقيقة واحدة.
جفف الأقسام بالهواء وقم بتغطيتها بزلة غطاء ، بعد لصق قطرة من الراتنج المحايد على العينات الموجودة على الشرائح. ثم التقط صورا باستخدام مجهر مضان مستقيم في مجال ساطع عند خمسة و 20X. انقع الهيماتوكسيلين والأقسام الملطخة بالأمونيا في 0.05٪ أخضر سريع لمدة دقيقتين.
يليه نقع الأقسام في محلول حمض الخليك 1٪ لمدة 30 ثانية ، و 0.1٪ سافرانين لمدة خمس دقائق. ثم قم بمعالجة الشرائح بالإيثانول والزيلين كما هو موضح سابقا. التقط صورا باستخدام مجهر مضان عمودي في مجال ساطع بمعدل 5X و 20X.
بعد ثلاثة أيام وثمانية أسابيع و 12 أسبوعا من الجراحة ، استغرقت مجموعات الأربطة المقطوعة وقتا أطول بكثير للمرور عبر عارضة التوازن مقارنة بالمجموعة الوهمية. قبل الجراحة ، كان طول خطوة القدم الخلفية اليمنى قابلا للمقارنة بين مجموعات الفئران الثلاث. ومع ذلك ، بعد 12 أسبوعا من الجراحة ، كان طول الخطوة أقصر في مجموعة قطع الأربطة منه في المجموعة الوهمية.
قبل الجراحة ، يكون وقت استجابة الإحساس الحراري لأقدام الفئران أثناء النشاط مشابها بين المجموعات الثلاث من الفئران. بعد الجراحة ، أظهرت الفئران في مجموعة قطع الأربطة أوقات استجابة أطول مقارنة بالمجموعة الوهمية. أظهر ASCJ للقدم الخلفية اليمنى في مجموعات الأربطة المقطوعة أسطح خشنة ، وتراكم العظم ، والتغيرات التنكسية.
وجزء حجم عظم أعلى بكثير من المجموعة الوهمية. أظهرت طبقة الغضروف من ASCJ في مجموعة قطع الرباط انقطاع ، وانخفاض عدد الخلايا الغضروفية. أيضا ، كانت الدرجات الدولية لجمعية مالكين وهشاشة العظام الدولية للفئران المصابة ببتر الأربطة أعلى بكثير من المجموعة الوهمية.
كان الكولاجين من النوع الثاني في طبقة الغضروف المفصلي ASCJ للمجموعة الوهمية للقدم الخلفية اليمنى أكثر اتساقا وأعلى من مجموعتي الفئران ذات الأربطة المقطوعة. يمكن استخدام هذه الدراسة لتشخيص وعلاج عدم استقرار الكاحل ، وتوفير مرجع تجريبي للعلاجات السريرية لهذا المرض.
