ASCJ 무능력 마우스 모델의 성공적인 확립은 단순한 발목 무능력 동물 모델을 확장하고 임상 발 질환 연구를 위한 새로운 개념을 제공합니다. 실제 임상 상황에 더 부합하는 동물 모델을 구축하여 발 질환의 진단 및 치료에 대한 추가 연구에 사용할 수 있습니다. 실험 일주일 전에 쥐에게 균형 빔 또는 U자형 파이프의 한쪽 끝에서 다른 쪽 끝으로 멈추지 않고 이동하면서 균형 빔과 보행 훈련을 실시합니다.
쥐의 오른쪽 뒷다리 발목 관절에 있는 털을 마취하고 제거한 후 노출된 피부를 요오드 면봉으로 소독합니다. 멸균 수술 패드를 사용하여 마우스를 미세 수술 동물 수술실로 옮깁니다. 횡경추 및 전방 거골 인대 그룹의 경우 오른쪽 발목 관절 위의 피부에 메스를 사용하여 7mm 비스듬한 아래쪽 세로 절개를 합니다.
그리고 발목 관절 앞쪽에 미세한 직선 집게가 있는 프로브. 거골 몸체와 비골의 아래쪽 경계에 있는 전방 거골 인대가 노출되도록 메스로 부드럽게 자릅니다. 긴 비골 힘줄과 짧은 비골 힘줄, 그리고 신근 digitorum longus 힘줄을 분리합니다.
경추 인대를 노출시키고 메스로 자릅니다. 경추 횡인대와 삼각인대 그룹의 경우 오른쪽 발목 관절의 내측 피부를 8mm 수직으로 절개하고 내측 연골과 DL을 뭉툭하게 분리하여 절단합니다. 그런 다음 앞에서 설명한 대로 경추 인대를 자릅니다.
가짜 그룹의 경우 오른쪽 발목 관절에 가짜 수술을 수행합니다. 멸균 생리식염수로 절개 부위를 씻어낸 후 5-0 수술용 나일론 실로 봉합한 후 봉합된 절개 부위를 요오드 면봉으로 소독합니다. 수술 후 2주가 지나 관절 각부종이 가라앉으면 매일 1시간씩 마우스 회전식 피로 기계에서 마우스를 운동시킵니다.
밸런스 빔 테스트를 위해 clamp 사진 삼각대 클립으로 한쪽 끝이 15도 기울어진 원형 나무 빔을 놓고 다른 쪽 끝을 닫힌 카세트에 연결된 작업 표면에 놓습니다. 수술 일주일 전에 균형 빔 훈련을 수행하여 마우스가 빔의 한쪽 끝에서 다른 쪽 끝으로 부드럽게 이동할 수 있도록 합니다. 마우스가 일시 중지하지 않고 60초 동안 빔을 두 번 통과하면 테스트를 통과한 것으로 간주합니다.
각 시도 후 밸런스 빔에 75% 알코올을 분사하여 이전 마우스의 잔류 냄새가 다음 마우스에 영향을 미치지 않도록 합니다. 밸런스 빔 테스트를 수행하고 밸런스 빔을 두 번 연속으로 통과하는 각 마우스의 평균 시간을 기록합니다. 그리고 오른쪽 뒷발이 빔에서 미끄러지는 횟수를 종속 변수로 사용합니다.
발자국 분석을 위해 실험 테이블에 U자형 플라스틱 채널을 놓고 플라스틱 채널의 한쪽 끝을 닫힌 카세트에 연결합니다. 채널에 일반 안료 용지를 평평하게 놓습니다. 그런 다음 양손으로 마우스를 잡고 무독성 빨간색과 녹색 안료로 앞발과 뒷발을 고르게 칠합니다.
이제 페인팅된 마우스를 채널의 한쪽 끝에 놓고 카세트의 다른 쪽 끝으로 이동하도록 합니다. 발자국이 있는 착색지를 가져다가 표시하고 통풍이 잘되고 그늘진 곳에서 말리십시오. 이전 마우스의 잔여 냄새가 다음 마우스에 영향을 미치지 않도록 각 마우스가 지나간 후 U자형 플라스틱 채널에 75% 알코올을 뿌립니다.
각 용지에서 세 개의 연속된 투명 마우스 발자국을 선택합니다. 눈금자를 사용하여 왼쪽 발자국과 오른쪽 발자국 사이의 계단 너비로 마우스 오른쪽 발 발자국의 계단 길이를 측정합니다. 미세한 핀셋과 가위를 사용하여 발목 표본 주변의 과도한 연조직을 제거합니다.
그런 다음 10% EDTA 석회질 제거 용액이 포함된 원심분리기 튜브에 표본을 넣고 다른 그룹을 표시합니다. 그런 다음 석회질 제거를 위해 원심분리기 튜브를 쉐이킹 테이블 위에 놓습니다. 하루에 한 번 석회질 제거 용액을 교체하고 검체의 석회질 제거를 결정합니다.
석회질 제거 1개월 후 그래디언트 알코올로 표본을 탈수한 다음 투명화 목적으로 N-부탄올을 8시간 동안 사용합니다. 마지막으로, 세척된 표본을 임베딩을 위해 코로나 위치에 파라핀에 담그십시오. 절단하기 전에 표본을 섭씨 4도의 냉장고에서 섭씨 영하 20도의 냉동고로 약 10분 동안 옮겨 완전한 평면 절단을 용이하게 합니다.
마이크로톰에 표본을 고정하고 6마이크로미터 두께로 절단합니다. 동시에 현미경을 사용하여 주사기 바늘이 뼈 조직에 쉽게 침투할 수 있도록 샘플이 예상 수준으로 절단되었는지 관찰합니다. 2개 또는 3개의 완전한 파라핀 섹션을 연속으로 절단한 후 섭씨 40도로 설정된 정제 기계로 옮겨 완전히 팽창시킵니다.
그런 다음 유리 슬라이드로 파라핀 섹션을 제거합니다. 마지막으로 슬라이드를 그룹과 숫자로 표시합니다. 현미경으로 온전한 ASCJ 관절 구조를 관찰합니다.
섭씨 60도에서 40-50분 동안 인큐베이터에 절편을 넣습니다. 그런 다음 원고에 설명 된대로 크실렌으로 섹션을 세 번 왁스를 제거합니다. 왁스를 제거한 부분을 100% 에탄올에 3분 동안 두 번 넣은 다음 90% 및 80% 에탄올을 각각 5분 동안 넣습니다.
그런 다음 이중 증류수로 5분 동안 섹션을 세척합니다. 헤마톡실린에 1분 동안 담근 후 무색이 될 때까지 이중 증류수로 절편을 씻습니다. 단면을 1% 산성 에탄올 분화 용액에 30초 동안 담그고 이중 증류수로 세척합니다.
절편을 1% 암모니아 용액으로 염색하고 이중 증류수로 세척한 후 에오신 염색 용액으로 1분 동안 샘플을 염색합니다. 그런 다음 95 % 및 100 % 에탄올에 각각 1 분 동안 연속적으로 넣으십시오. 마지막으로 1분 동안 크실렌 4개로 절편을 처리합니다.
섹션을 공기 중에서 건조시키고 슬라이드의 표본에 중성 수지 한 방울을 붙인 후 커버 슬립으로 덮습니다. 그런 다음 정립 형광 현미경으로 5배와 20배의 명시야에서 이미지를 촬영합니다. 헤마톡실린과 암모니아로 얼룩진 부분을 0.05%의 빠른 녹색에 2분 동안 담그십시오.
이어서 절편을 1% 아세트산 용액에 30초 동안 담그고, 0.1% 사프라닌을 5분 동안 담근다. 그런 다음 앞에서 설명한 대로 에탄올과 자일렌으로 슬라이드를 처리합니다. 정립 형광 현미경으로 5X 및 20X의 명시야에서 이미지를 촬영합니다.
수술 3일, 8주, 12주 후, 절단된 인대 그룹은 가짜 그룹보다 밸런스 빔을 통과하는 데 훨씬 더 오래 걸렸습니다. 수술 전, 오른쪽 뒷발 걸음 길이는 세 쥐 그룹 간에 비슷했다. 그러나 수술 후 12주가 지나자 인대 절단군이 가짜 군보다 보폭 길이가 짧았다.
수술 전, 활동 중 쥐 발의 열 통각 반응 시간은 세 그룹의 쥐 간에 유사합니다. 수술 후 인대 절단 그룹의 마우스는 가짜 그룹에 비해 더 긴 반응 시간을 보였습니다. 절단된 인대 그룹에서 오른쪽 뒷발의 ASCJ는 거친 표면, 골사상균 축적, 퇴행성 변화를 보였습니다.
그리고 가짜 그룹보다 훨씬 더 높은 골량 분율. 인대 절단군에서 ASCJ의 연골층은 불연속성을 보였고, 연골세포의 수가 감소했다. 또한, 인대 절단 수술을 받은 쥐의 Malkin and Osteoarthritis Research Society International 점수는 가짜 그룹보다 유의하게 높았다.
가짜 그룹의 오른쪽 뒷발 ASCJ 관절 연골층에 있는 제2형 콜라겐은 인대가 절단된 두 그룹의 쥐보다 더 균일하고 높았습니다. 이 연구는 발목 불안정성의 진단 및 치료에 사용될 수 있으며 이 질병의 임상 치료를 위한 실험적 참고 자료를 제공합니다.
