踝距下复杂关节不稳定的小鼠模型

ASCJ无能小鼠模型的成功建立扩展了简单的踝关节无能动物模型，为临床足部疾病的研究提供了新的概念。我们建立了更符合实际临床情况的动物模型，可用于足部疾病诊断和治疗的进一步研究。实验前一周，对小鼠进行平衡木和步态训练，从平衡木或U形管的一端到另一端，不停地进行。

麻醉并去除小鼠右后肢踝关节上的毛发后，用碘拭子对暴露的皮肤进行消毒。使用无菌手术垫将小鼠转移到显微外科动物手术室。对于颈横韧带和距腓前韧带组，用手术刀在右踝关节上方的皮肤上做一个 7 毫米的斜向下纵向切口。

并在踝关节前部用显微的直镊进行探头。确保距骨体和腓骨下缘的距腓前韧带暴露，用手术刀轻轻切开。分离腓骨长肌腱和腓骨短肌腱，以及趾长伸肌腱。

露出颈部韧带，用手术刀切开。对于颈横韧带加三角韧带组，在右踝关节内侧皮肤上做一个8毫米的垂直切口，钝地将DL与内踝分开进行切割。然后如前所述切断颈椎韧带。

对于假手术组，对右踝关节进行假手术。用无菌生理盐水冲洗切口后，用 5-0 手术尼龙线缝合，然后用碘拭子对缝合的切口进行消毒。一旦手术后两周角关节肿胀减轻，每天在小鼠旋转疲劳机中锻炼小鼠一小时。

对于平衡木测试，用摄影三脚架夹夹住一端倾斜 15 度的圆形木梁，并将另一端放在连接到封闭盒的工作台面上。手术前一周进行平衡木训练，以确保小鼠顺利地从平衡木的一端移动到另一端。假设一只鼠标在 60 秒内两次穿过光束而没有停顿，它就通过了测试。

每次试验后，用75%的酒精喷洒平衡木，以呈现前一只小鼠的残留气味，以免影响下一只小鼠。进行平衡木测试，记录每只鼠标连续两次通过平衡木的平均时间。右后脚从横梁上滑落的次数，作为因变量。

对于足迹分析，在实验台上放置一个U形塑料通道，并将塑料通道的一端连接到封闭的盒中。将普通颜料纸平放在通道中。然后用双手握住鼠标，用无毒的红色和绿色颜料均匀地涂上前脚和后脚。

现在，将涂漆的鼠标放在通道的一端，并让它移动到盒的另一端。取带有脚印的颜料纸，标记，并在通风和阴凉处晾干。每只老鼠通过后，用75%的酒精喷洒U形塑料通道，以防止前一只老鼠的残留气味影响下一只老鼠。

在每张纸上选择三个连续的清除鼠标足迹。用尺子测量鼠标右脚脚印的步长，左右脚印之间的步宽。使用显微镊子和剪刀去除脚踝标本周围多余的软组织。

然后，将试样放入含有10%EDTA脱钙溶液的离心管中，并标记不同的组。接下来，将离心管放在振动台上进行脱钙。每天更换一次脱钙液，并确定试样的脱钙情况。

脱钙一个月后，用梯度醇使试样脱水，然后使用正丁醇八小时进行澄清。最后，将清除的标本浸入石蜡中的冠状位置进行包埋。切片前，将试样从4摄氏度的冰箱转移到零下20摄氏度的冰箱中约10分钟，以方便整个平面切割。

将标本固定在切片机上，并将它们切成六微米的厚度。同时，使用显微镜观察样品是否已切割到预期的水平，以便于将注射器针头穿透骨组织。连续切割两到三个完整的石蜡切片后，将它们转移到40摄氏度的压片机中，以使其完全膨胀。

然后用载玻片取出石蜡部分。最后，用组和数字标记幻灯片。在显微镜下观察完整的ASCJ关节结构。

将切片放入 60 摄氏度的培养箱中 40 至 50 分钟。然后用二甲苯对切片进行三次脱蜡，如手稿中所述。将脱蜡切片置于 100% 乙醇中两次，每次 3 分钟，然后加入 90% 和 80% 乙醇，每次 5 分钟。

然后用双蒸水清洗这些部分五分钟。在苏木精中浸泡一分钟后，用双蒸水洗涤切片，直到它们变成无色。将切片浸泡在1%酸性乙醇分化液中30秒，并用双蒸水洗涤。

用1%氨溶液染色切片并用双蒸水洗涤后，用曙红染色液对样品染色一分钟。然后将它们连续放入 95% 和 100% 乙醇中，每次一分钟。最后，用二甲苯四处理切片一分钟。

将一滴中性树脂粘贴到载玻片上的标本上后，将切片风干并用盖玻片覆盖。然后用正置荧光显微镜在明场中以 5 倍和 20 倍的速度拍摄图像。将苏木精和氨染色切片浸泡在 0.05%固绿中两分钟。

然后将切片浸泡在 1% 乙酸溶液中 30 秒，将 0.1% 番红浸泡 5 分钟。然后如前所述，用乙醇和二甲苯处理载玻片。用正置荧光显微镜在明场中以 5X 和 20X 拍摄图像。

经过 3 天、8 周和 12 周的手术后，断韧带组通过平衡木的时间明显长于假韧带组。术前，三组小鼠的右后足步长相当。然而，术后 12 周，韧带切割组的步长比假切割组短。

手术前，三组小鼠在活动期间足部的热伤害感受反应时间相似。手术后，与假手术组相比，韧带切割组的小鼠表现出更长的反应时间。断韧带组右后足ASCJ表现为表面粗糙、骨赘堆积、退行性改变。

并且骨体积分数明显高于假手术组。韧带切割组ASCJ软骨层出现不连续性，软骨细胞数量减少。此外，韧带截肢小鼠的Malkin和骨关节炎研究学会国际评分显著高于假手术组。

假手术组右后足ASCJ关节软骨层的2型胶原更均匀，高于两组断韧带小鼠。本研究可用于踝关节不稳的诊断和治疗，为该病的临床治疗提供实验参考。