ההקמה המוצלחת של מודל עכבר חוסר היכולת ASCJ מרחיבה מודל פשוט של בעלי חיים עם חוסר יכולת בקרסול, ומספקת מושגים חדשים לחקר מחלות כף הרגל הקליניות. הקמנו מודל של בעלי חיים שמתאים יותר למצב הקליני בפועל, שיכול לשמש למחקר נוסף על אבחון וטיפול במחלות כף הרגל. שבוע לפני הניסוי, העבירו את העכברים לאימוני קרן איזון והליכה, כשהם עוברים מקצה אחד של קרן שיווי משקל או צינור בצורת U לקצה השני, ללא הפסקה.
לאחר הרדמה והסרת השיער על מפרק הקרסול של הגפיים האחוריות הימניות של העכבר, יש לחטא את העור החשוף במקלון יוד. העבירו את העכבר לחדר הניתוח של בעלי החיים באמצעות כרית כירורגית סטרילית. עבור קבוצות הרצועה הצווארית הרוחבית והקדמית, בצע חתך אורכי אלכסוני של שבעה מילימטר כלפי מטה עם אזמל על העור מעל מפרק הקרסול הימני.
ובדיקה עם מלקחיים ישרים מיקרוסקופיים בחלק הקדמי של מפרק הקרסול. הבטחת החשיפה של הרצועה הטאלופיבולרית הקדמית בגבול התחתון של גוף הטלוס והפיבולה, חתכו אותה בעדינות עם אזמל. להפריד את הגידים הפיבולאריים הארוכים והקצרים, ואת הגידים extensor digitorum longus.
לחשוף את הרצועה הצווארית, לחתוך אותו עם אזמל. עבור הרצועה הצווארית הרוחבית בתוספת קבוצת רצועות דלטואיד, בצע חתך אנכי של שמונה מילימטר בעור המדיאלי של מפרק הקרסול הימני, והפריד בבוטות את ה- DL מהמליאולוס המדיאלי כדי לחתוך אותו. לאחר מכן חתכו את הרצועה הצווארית כפי שהודגם קודם לכן.
עבור קבוצת דמה, לבצע ניתוח דמה על מפרק קרסול ימין. לאחר שטיפת החתך במי מלח סטריליים רגילים, תפרו אותו בחוט ניילון כירורגי 5-0, ולאחר מכן חיטוי החתך שנתפר במקלון יוד. לאחר שהנפיחות במפרק הזווית פחתה שבועיים לאחר הניתוח, הפעילו את העכברים במכונת העייפות הסיבובית של העכבר במשך שעה אחת בכל יום.
לבדיקת קרן שיווי המשקל, הדקו קורת עץ עגולה בשיפוע של 15 מעלות בקצה אחד עם קליפס חצובה לצילום, והניחו את הקצה השני על משטח עבודה המחובר לקסטה סגורה. בצעו אימון קרן שיווי משקל שבוע לפני הניתוח כדי להבטיח שהעכברים ינועו בצורה חלקה מקצה אחד של הקרן לקצה השני. חשבו על עכבר שעבר את המבחן כאשר הוא עובר דרך הקרן פעמיים ב-60 שניות מבלי להשהות.
לאחר כל ניסוי, רססו את קרן האיזון ב-75% אלכוהול כדי להציג את שאריות הריח של העכבר הקודם מלהשפיע על העכבר הבא. בצע את בדיקת קרן האיזון ורשום את הזמן הממוצע של כל עכבר העובר את קרן האיזון פעמיים ברציפות. ומספר הפעמים שרגל ימין אחורית מחליקה מהקורה, כמשתנים תלויים.
לניתוח טביעת רגל, הניחו תעלת פלסטיק בצורת U על שולחן הניסוי, וחברו קצה אחד של תעלת הפלסטיק לקסטה סגורה. מניחים נייר פיגמנטי רגיל שטוח בתעלה. לאחר מכן החזיקו את העכבר בשתי הידיים, וצבעו את הרגליים הקדמיות והאחוריות באופן שווה בפיגמנט אדום וירוק לא רעיל.
כעת, מקם את העכבר הצבוע בקצה אחד של הערוץ, ואפשר לו לעבור לקצה השני של הקלטת. קחו את הנייר הפיגמנטי עם טביעות הרגל, סמנו אותו והניחו לו להתייבש בחלל מאוורר ומוצל. רססו את תעלת הפלסטיק בצורת U ב-75% אלכוהול לאחר שכל עכבר עבר, כדי למנוע משאריות הריח של העכבר הקודם להשפיע על העכבר הבא.
בחר שלוש טביעות רגל רצופות של עכבר ברור על כל נייר. בעזרת סרגל, מדוד את אורך הצעד של טביעת הרגל הימנית של העכבר, עם רוחב הצעד בין טביעת הרגל השמאלית והימנית. השתמש בפינצטה מיקרוסקופית ובמספריים כדי להסיר רקמות רכות עודפות סביב דגימות הקרסול.
לאחר מכן, הניחו את הדגימות בצינור צנטריפוגה המכיל תמיסת הסתיידות EDTA של 10%, וסמנו את הקבוצות השונות. לאחר מכן, מניחים את צינור הצנטריפוגה על שולחן רועד לצורך הסתיידות. שנה את תמיסת ההסתיידות פעם ביום, וקבע את ההסתיידות של הדגימות.
לאחר חודש של הסתיידות, יש לייבש את הדגימות באלכוהול הדרגתי, ולאחר מכן להשתמש ב-N-בוטאנול במשך שמונה שעות למטרות ניקוי. לבסוף, לטבול את הדגימות שסולקו בפרפין במצב קורונלי להטמעה. לפני החיתוך, מעבירים את הדגימות מהמקרר בארבע מעלות צלזיוס למקפיא מינוס 20 מעלות צלזיוס למשך כ-10 דקות, כדי להקל על חיתוך המטוסים המלא.
מקבעים את הדגימות על המיקרוטום וחותכים אותן בעובי של שישה מיקרומטר. במקביל, השתמש במיקרוסקופ כדי לבחון אם הדגימות נחתכו ברמה הצפויה לחדירה קלה של מחט מזרק לתוך רקמת העצם. לאחר חיתוך שניים או שלושה קטעי פרפין שלמים ברציפות, להעביר אותם למכונת הטבליה, להגדיר על 40 מעלות צלזיוס, להרחבה מלאה.
לאחר מכן הסר את חלקי הפרפין עם שקופית זכוכית. לבסוף, סמן את השקופיות בקבוצות ובמספרים. להתבונן במבנה המפרק ASCJ השלם תחת מיקרוסקופ.
מניחים את המקטעים באינקובטור בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך 40 עד 50 דקות. לאחר מכן הסר את השעווה מהקטעים עם קסילן שלוש פעמים, כמתואר בכתב היד. הניחו את החלקים ללא שעווה באתנול 100% פעמיים למשך שלוש דקות, ולאחר מכן 90% ו-80% אתנול למשך חמש דקות כל אחד.
לאחר מכן לשטוף את החלקים עם מים מזוקקים כפול במשך חמש דקות. לאחר השריה בהמטוקסילין למשך דקה, שטפו את החלקים במים מזוקקים כפול עד שהם הופכים לחסרי צבע. השרו את החלקים בתמיסת התמיינות אתנול 1% חומצה למשך 30 שניות, ושטפו אותם במים מזוקקים כפול.
לאחר שהחלקים מוכתמים בתמיסת 1% אמוניה, ונשטפים במים מזוקקים כפול, מכתימים את הדגימות בתמיסת צביעת אאוזין למשך דקה. ואז לשים אותם 95% ו 100% אתנול ברצף במשך דקה אחת כל אחד. לבסוף, לטפל בחלקים עם קסילן ארבע במשך דקה אחת.
ייבשו את החלקים באוויר וכסו אותם בהחלקת כיסוי, לאחר הדבקת טיפת שרף נייטרלי על הדגימות שעל המגלשות. לאחר מכן צלם תמונות עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף בשדה בהיר במהירות של פי חמישה ופי 20. משרים את חלקי ההמטוקסילין והאמוניה בירוק מהיר של 0.05% למשך שתי דקות.
לאחר מכן השריית החלקים בתמיסת חומצה אצטית 1% למשך 30 שניות, ו-0.1% ספרנין למשך חמש דקות. לאחר מכן עבד את השקופיות עם אתנול וקסילן כפי שהודגם קודם לכן. צלם תמונות עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף בשדה בהיר של 5X ו- 20X.
לאחר שלושה ימים, שמונה שבועות ו-12 שבועות של ניתוח, לקבוצות הרצועות הקטועות לקח זמן רב יותר לעבור דרך קרן האיזון מאשר לקבוצת הדמה. לפני הניתוח, אורך הצעד של כף רגל ימין אחורית היה דומה בין שלוש קבוצות העכברים. עם זאת, 12 שבועות לאחר הניתוח, אורך הצעד היה קצר יותר בקבוצת חתך הרצועה מאשר בקבוצת הדמה.
לפני הניתוח, זמן התגובה התרמית של רגלי העכברים במהלך הפעילות דומה בין שלוש קבוצות העכברים. לאחר הניתוח, העכברים בקבוצת חתך הרצועה הציגו זמני תגובה ארוכים יותר בהשוואה לקבוצת הדמה. ASCJ של כף רגל ימין האחורית בקבוצות רצועות קטועות הראה משטחים גסים, הצטברות אוסטאופיטים, שינויים ניווניים.
ומקטע נפח עצם גבוה משמעותית מקבוצת הדמה. שכבת הסחוס של ASCJ בקבוצת חתך הרצועה הראתה חוסר רציפות, וירידה במספר הכונדרוציטים. כמו כן, ציוני החברה הבינלאומית לחקר מלקין ואוסטאוארתריטיס של העכברים עם קטיעת רצועות היו גבוהים משמעותית מקבוצת הדמה.
הקולגן מסוג 2 בשכבת הסחוס המפרקי ASCJ של כף רגל ימין האחורית היה אחיד יותר, וגבוה מזה של שתי קבוצות העכברים עם רצועות קטועות. מחקר זה יכול לשמש לאבחון ולטיפולים באי יציבות בקרסול, ולספק התייחסות ניסיונית לטיפולים הקליניים במחלה זו.
