O estabelecimento bem-sucedido do modelo de camundongo com incapacidade da ASCC estende um modelo animal simples de incapacidade do tornozelo e fornece um novo conceito para o estudo das doenças clínicas do pé. Estabelecemos um modelo animal mais condizente com a situação clínica real, que pode ser utilizado para novas pesquisas sobre o diagnóstico e o tratamento das doenças do pé. Uma semana antes do experimento, submeter os camundongos ao treinamento de equilíbrio e marcha, indo de uma extremidade de uma viga de equilíbrio ou tubo em forma de U para a outra, sem parar.
Depois de anestesiar e remover os pelos na articulação do tornozelo dos membros posteriores direitos do rato, desinfete a pele exposta com um cotonete de iodo. Transfira o camundongo para a sala de cirurgia do animal de microcirurgia usando uma almofada cirúrgica estéril. Para os grupos do ligamento transverso cervical e do ligamento talofibular anterior, fazer uma incisão longitudinal oblíqua descendente de sete milímetros com bisturi na pele acima da articulação do tornozelo direito.
E sonda com pinça reta microscópica na frente da articulação do tornozelo. Garantindo a exposição do ligamento talofibular anterior na borda inferior do corpo do tálus e da fíbula, corte-o suavemente com um bisturi. Separe os tendões fibulares longo e curto e os tendões extensor longo dos dedos.
Exponha o ligamento cervical e corte-o com bisturi. Para o grupo ligamento transverso cervical mais ligamento deltoide, faça uma incisão vertical de oito milímetros na pele medial da articulação do tornozelo direito e separe o DL do maléolo medial para cortá-lo. Em seguida, corte o ligamento cervical como demonstrado anteriormente.
Para o grupo simulado, realizar cirurgia simulada na articulação do tornozelo direito. Após lavar a incisão com soro fisiológico estéril, suturá-la com fio de náilon cirúrgico 5-0, seguido de desinfecção da incisão suturada com swab de iodo. Uma vez que o inchaço da articulação angular tenha diminuído em duas semanas após a cirurgia, exercite os ratos na máquina de fadiga rotativa do mouse por uma hora todos os dias.
Para o teste do feixe de equilíbrio, prenda uma viga circular de madeira inclinada a 15 graus em uma extremidade com um clipe de tripé de fotografia e coloque a outra extremidade em uma superfície de trabalho conectada a um fechado. Realize o treinamento do feixe de equilíbrio uma semana antes da cirurgia para garantir que os camundongos se movam suavemente de uma extremidade da viga para a outra. Considere que um mouse passou no teste quando ele passa pelo feixe duas vezes em 60 segundos sem pausar.
Após cada tentativa, borrife o feixe de equilíbrio com álcool a 75% para apresentar o odor residual do rato anterior de afetar o rato seguinte. Realize o teste do feixe de equilíbrio e registre o tempo médio de cada mouse passando o feixe de equilíbrio duas vezes seguidas. E o número de vezes que o retropé direito escorrega da trave, como variáveis dependentes.
Para a análise da pegada ecológica, coloque um canal de plástico em forma de U na mesa experimental e conecte uma extremidade do canal de plástico a um fechado. Coloque um papel pigmentado liso no canal. Em seguida, segure o mouse com as duas mãos e pinte os pés dianteiros e traseiros uniformemente com pigmento vermelho e verde atóxico.
Agora, coloque o mouse pintado em uma extremidade do canal e permita que ele se mova para a outra extremidade do. Pegue o papel pigmentado com as pegadas, marque-o e deixe secar em um espaço ventilado e sombreado. Borrife o canal de plástico em forma de U com 75% de álcool após cada rato ter passado, para evitar que o odor residual do rato anterior afecte o rato seguinte.
Selecione três pegadas claras consecutivas do mouse em cada papel. Usando uma régua, meça o comprimento do passo da pegada do pé direito do mouse, com a largura do passo entre as pegadas esquerda e direita. Use pinças e tesouras microscópicas para remover o excesso de tecido mole ao redor dos espécimes do tornozelo.
Em seguida, colocar os espécimes em um tubo centrífugo contendo uma solução de descalcificação de EDTA a 10% e marcar os diferentes grupos. Em seguida, coloque o tubo centrífugo em uma mesa de agitação para descalcificação. Troque a solução de descalcificação uma vez por dia e determine a descalcificação dos espécimes.
Após um mês da descalcificação, desidratar os espécimes com álcool gradiente e, em seguida, usar N-butanol por oito horas para fins de clareamento. Finalmente, imergir os espécimes limpos em parafina em posição coronal para incorporação. Antes de seccionar, transfira os espécimes do refrigerador de quatro graus Celsius para um freezer de 20 graus Celsius negativos por cerca de 10 minutos, para facilitar o corte completo dos planos.
Fixar os corpos de prova no micrótomo e seccioná-los numa espessura de seis micrómetros. Ao mesmo tempo, use um microscópio para observar se as amostras foram cortadas no nível esperado para facilitar a penetração de uma agulha de seringa no tecido ósseo. Depois de cortar duas ou três seções completas de parafina seguidas, transfira-as para a máquina de comprimidos, ajustada a 40 graus Celsius, para expansão total.
Em seguida, remova as seções de parafina com uma lâmina de vidro. Por fim, marque os slides com grupos e números. Observar a estrutura articular intacta da JASC ao microscópio.
Coloque as seções em uma incubadora regulada a 60 graus Celsius por 40 a 50 minutos. Em seguida, desencremar as seções com xileno três vezes, conforme descrito no manuscrito. Colocar as seções desenceradas em etanol 100% duas vezes por três minutos, seguidas de etanol 90% e 80% por cinco minutos cada.
Em seguida, lave as seções com água bidestilada por cinco minutos. Após imersão em Hematoxilina por um minuto, lave os cortes com água bidestilada até que fiquem incolores. Mergulhe as seções em solução de diferenciação de etanol ácido a 1% por 30 segundos e lave-as com água bidestilada.
Uma vez que os cortes são corados com solução de amônia a 1% e lavados com água bidestilada, corar as amostras com solução corante de eosina por um minuto. E depois colocá-los em 95% e 100% de etanol em sequência por um minuto cada. Finalmente, trate as seções com xileno quatro por um minuto.
Seque ao ar as seções e cubra-as com uma lamínula, depois de colar uma gota de resina neutra nos corpos de prova nas lâminas. Em seguida, tire fotos com um microscópio de fluorescência vertical em campo brilhante a cinco e 20X. Deixar os cortes corados pela hematoxilina e amônia em verde 0,05% rápido por dois minutos.
Em seguida, as seções foram imersas em solução de ácido acético a 1% por 30 segundos e safranina a 0,1% por cinco minutos. Em seguida, processe as lâminas com etanol e xileno, conforme demonstrado anteriormente. Tire fotos com um microscópio de fluorescência vertical em campo brilhante a 5X e 20X.
Após três dias, oito semanas e 12 semanas de cirurgia, os grupos ligamentares cortados levaram significativamente mais tempo para passar pela trave de equilíbrio do que o grupo simulado. Antes da cirurgia, o comprimento do passo do pé posterior direito era comparável entre os três grupos de camundongos. No entanto, 12 semanas após a cirurgia, o comprimento do passo foi menor no grupo corte ligamentar do que no grupo simulado.
Antes da cirurgia, o tempo de resposta à nocicepção térmica dos pés dos camundongos durante a atividade é semelhante entre os três grupos de camundongos. Após a cirurgia, os camundongos do grupo corte ligamentar apresentaram tempos de resposta mais longos em comparação com o grupo sham. A JSCA do retropé direito nos grupos ligamentares cortados mostrou superfícies rugosas, acúmulo de osteófitos, alterações degenerativas.
E fração de volume ósseo significativamente maior do que o grupo sham. A camada cartilaginosa da JSCA no grupo corte ligamentar apresentou descontinuidade e diminuição do número de condrócitos. Além disso, os escores da Malkin and Osteoarthritis Research Society International dos camundongos com amputação ligamentar foram significativamente maiores do que o grupo sham.
O colágeno tipo dois na camada de cartilagem articular da JASC do retropé direito do grupo sham foi mais uniforme e mais alto do que o dos dois grupos de camundongos com ligamentos rompidos. Este estudo pode ser utilizado para o diagnóstico e o tratamento da instabilidade do tornozelo, além de servir de referência experimental para o tratamento clínico desta doença.
