El establecimiento exitoso del modelo de ratón con discapacidad de ASCJ amplía un modelo animal simple de incapacidad de tobillo y proporciona nuevos conceptos para el estudio de las enfermedades clínicas del pie. Hemos establecido un modelo animal más acorde con la situación clínica real, que puede utilizarse para futuras investigaciones sobre el diagnóstico y el tratamiento de las enfermedades del pie. Una semana antes del experimento, somete a los ratones a un entrenamiento de barra de equilibrio y marcha, yendo de un extremo de una barra de equilibrio o tubo en forma de U al otro, sin parar.
Después de anestesiar y eliminar el vello de la articulación del tobillo de las extremidades traseras derechas del ratón, desinfecte la piel expuesta con un hisopo de yodo. Transfiera el ratón al quirófano de animales de microcirugía con una almohadilla quirúrgica estéril. Para los grupos de ligamento cervical transverso y talofibular anterior, haga una incisión longitudinal oblicua hacia abajo de siete milímetros con un bisturí en la piel por encima de la articulación del tobillo derecho.
Y sondea con pinzas rectas microscópicas en la parte delantera de la articulación del tobillo. Asegurando la exposición del ligamento talofibular anterior en el borde inferior del astrágalo y el peroné, córtelo suavemente con un bisturí. Separe los tendones largos y cortos del peroné, y los tendones extensores largos de los dedos.
Expone el ligamento cervical y córtalo con un bisturí. Para el grupo del ligamento cervical transverso más el ligamento deltoides, haga una incisión vertical de ocho milímetros en la piel medial de la articulación del tobillo derecho y separe sin rodeos el DL del maléolo medial para cortarlo. A continuación, corte el ligamento cervical como se demostró anteriormente.
Para el grupo simulado, realice una cirugía simulada en la articulación del tobillo derecho. Después de enjuagar la incisión con solución salina normal estéril, suturarla con hilo de nailon quirúrgico 5-0, seguido de desinfectar la incisión suturada con un hisopo de yodo. Una vez que la hinchazón de la articulación angular se haya reducido dos semanas después de la cirugía, ejercite a los ratones en la máquina rotativa de fatiga del ratón durante una hora todos los días.
Para la prueba de la barra de equilibrio, sujete una viga de madera circular inclinada a 15 grados en un extremo con un clip de trípode fotográfico y coloque el otro extremo sobre una superficie de trabajo conectada a un casete cerrado. Realice el entrenamiento con barra de equilibrio una semana antes de la cirugía para asegurarse de que los ratones se muevan suavemente de un extremo a otro de la viga. Considere que un ratón ha pasado la prueba cuando pasa a través del haz dos veces en 60 segundos sin pausa.
Después de cada prueba, rocíe la barra de equilibrio con alcohol al 75% para presentar el olor residual del ratón anterior para que no afecte al siguiente ratón. Realice la prueba de la barra de equilibrio y registre el tiempo promedio de cada mouse que pasa por la barra de equilibrio dos veces seguidas. Y el número de veces que el pie trasero derecho se sale de la viga, como variables dependientes.
Para el análisis de la huella, coloque un canal de plástico en forma de U en la mesa experimental y conecte un extremo del canal de plástico a un casete cerrado. Coloque un papel de pigmento liso plano en el canal. Luego sostenga el mouse con ambas manos y pinte las patas delanteras y traseras de manera uniforme con pigmento rojo y verde no tóxico.
Ahora, coloque el mouse pintado en un extremo del canal y deje que se mueva al otro extremo del casete. Toma el papel pigmentado con las huellas, márcalo y déjalo secar en un espacio ventilado y sombreado. Rocíe el canal de plástico en forma de U con alcohol al 75% después de que haya pasado cada ratón, para evitar que el olor residual del ratón anterior afecte al siguiente.
Seleccione tres huellas de ratón transparentes consecutivas en cada papel. Con una regla, mida la longitud del paso de la huella del pie derecho del ratón, con el ancho del paso entre las huellas izquierda y derecha. Use pinzas microscópicas y tijeras para eliminar el exceso de tejido blando alrededor de los especímenes de tobillo.
Y luego, coloque las muestras en un tubo de centrífuga que contenga una solución de descalcificación de EDTA al 10% y marque los diferentes grupos. A continuación, coloque el tubo de centrífuga en una mesa vibratoria para su descalcificación. Cambie la solución de descalcificación una vez al día y determine la descalcificación de las muestras.
Después de un mes de descalcificación, deshidrate las muestras con alcohol de gradiente y luego use N-butanol durante ocho horas para limpiarlas. Finalmente, sumerja las muestras aclaradas en parafina en una posición coronal para su inclusión. Antes de seccionar, transfiera las muestras del refrigerador de cuatro grados centígrados a un congelador de menos 20 grados centígrados durante unos 10 minutos, para facilitar el corte completo de los planos.
Fije las muestras en el micrótomo y córtelas en un grosor de seis micrómetros. Al mismo tiempo, use un microscopio para observar si las muestras se han cortado al nivel esperado para facilitar la penetración de una aguja de jeringa en el tejido óseo. Después de cortar dos o tres secciones completas de parafina seguidas, transfiéralas a la máquina de tabletas, ajustada a 40 grados centígrados, para una expansión completa.
A continuación, retire las secciones de parafina con un portaobjetos de vidrio. Por último, marca las diapositivas con grupos y números. Observar la estructura intacta de la articulación ASCJ bajo un microscopio.
Coloque las secciones en una incubadora a 60 grados centígrados durante 40 a 50 minutos. A continuación, desparafinar las secciones con xileno tres veces, como se describe en el manuscrito. Coloque las secciones desparafinadas en etanol al 100% dos veces durante tres minutos, seguidas de etanol al 90% y al 80% durante cinco minutos cada una.
A continuación, lave las secciones con agua bidestilada durante cinco minutos. Después de remojar en hematoxilina durante un minuto, lave las secciones con agua bidestilada hasta que se vuelvan incoloras. Remoje las secciones en una solución de diferenciación de etanol ácido al 1% durante 30 segundos y lávelas con agua bidestilada.
Una vez que las secciones se tiñen con una solución de amoníaco al 1% y se lavan con agua bidestilada, tiña las muestras con una solución de tinción de eosina durante un minuto. Y luego ponerlos en etanol al 95% y al 100% sucesivamente durante un minuto cada uno. Por último, trata las secciones con xileno cuatro durante un minuto.
Secar al aire las secciones y cubrirlas con un cubreobjetos, después de pegar una gota de resina neutra sobre las muestras en los portaobjetos. A continuación, tome imágenes con un microscopio de fluorescencia vertical en campo claro a cinco y 20X. Remoje las secciones teñidas de hematoxilina y amoníaco en verde rápido al 0,05 % durante dos minutos.
A continuación, remojar las secciones en una solución de ácido acético al 1% durante 30 segundos y safranina al 0,1% durante cinco minutos. A continuación, procese los portaobjetos con etanol y xileno como se demostró anteriormente. Tome imágenes con un microscopio de fluorescencia vertical en campo claro a 5X y 20X.
Después de tres días, ocho semanas y 12 semanas de cirugía, los grupos de ligamentos cortados tardaron significativamente más en pasar a través de la barra de equilibrio que el grupo simulado. Antes de la cirugía, la longitud del paso del pie trasero derecho era comparable entre los tres grupos de ratones. Sin embargo, 12 semanas después de la cirugía, la longitud del paso fue más corta en el grupo de corte de ligamentos que en el grupo simulado.
Antes de la cirugía, el tiempo de respuesta de la nocicepción térmica de las patas de los ratones durante la actividad es similar entre los tres grupos de ratones. Después de la cirugía, los ratones en el grupo de corte de ligamentos mostraron tiempos de respuesta más largos en comparación con el grupo simulado. La ASCJ del pie trasero derecho en los grupos de ligamentos cortados mostró superficies rugosas, acumulación de osteofitos, cambios degenerativos.
Y una fracción de volumen óseo significativamente mayor que el grupo simulado. La capa de cartílago de la ASCJ en el grupo de corte de ligamentos mostró discontinuidad y disminución del número de condrocitos. Además, las puntuaciones de Malkin y la Sociedad Internacional de Investigación de la Osteoartritis de los ratones con amputación de ligamentos fueron significativamente más altas que las del grupo simulado.
El colágeno tipo dos en la capa de cartílago articular ASCJ del grupo simulado del pie trasero derecho fue más uniforme y más alto que el de los dos grupos de ratones con ligamentos cortados. Este estudio puede ser utilizado para el diagnóstico y los tratamientos de la inestabilidad del tobillo, y proporcionar una referencia experimental para los tratamientos clínicos de esta enfermedad.
