La mise en place réussie du modèle murin d’incapacité ASCJ étend un modèle animal simple d’incapacité de la cheville et fournit de nouveaux concepts pour l’étude des maladies cliniques du pied. Nous avons établi un modèle animal plus conforme à la situation clinique réelle, qui peut être utilisé pour d’autres recherches sur le diagnostic et le traitement des maladies du pied. Une semaine avant l’expérience, soumettez les souris à un entraînement à la poutre d’équilibre et à la démarche, en allant d’une extrémité d’une poutre d’équilibre ou d’un tuyau en forme de U à l’autre, sans s’arrêter.
Après avoir anesthésié et enlevé les poils de l’articulation de la cheville des membres postérieurs droits de la souris, désinfectez la peau exposée avec un tampon à l’iode. Transférez la souris dans la salle d’opération de microchirurgie animale à l’aide d’un tampon chirurgical stérile. Pour les groupes ligamentaires cervicaux transverses et tato-fibulaires antérieurs, faites une incision longitudinale oblique vers le bas de sept millimètres avec un scalpel sur la peau au-dessus de l’articulation de la cheville droite.
Et sonde avec pince droite microscopique à l’avant de l’articulation de la cheville. En veillant à l’exposition du ligament talo-fibulaire antérieur au bord inférieur du corps du talus et du péroné, coupez-le doucement avec un scalpel. Séparez les tendons fibulaires longs et courts, ainsi que les tendons longs extenseurs des doigts.
Exposez le ligament cervical et coupez-le avec un scalpel. Pour le groupe ligament cervical transverse et ligament deltoïde, faites une incision verticale de huit millimètres sur la peau médiale de l’articulation de la cheville droite et séparez carrément le DL de la malléole médiale pour la couper. Coupez ensuite le ligament cervical comme démontré précédemment.
Pour le groupe simulé, effectuez une chirurgie simulée sur l’articulation de la cheville droite. Après avoir rincé l’incision avec une solution saline normale stérile, suturez-la avec du fil de nylon chirurgical 5-0, puis désinfectez l’incision suturée avec un tampon à l’iode. Une fois que le gonflement de l’articulation angulaire a diminué deux semaines après la chirurgie, faites travailler les souris dans la machine à fatigue rotative de souris pendant une heure chaque jour.
Pour le test de la poutre d’équilibre, fixez une poutre circulaire en bois inclinée à 15 degrés à une extrémité avec un clip pour trépied photographique et placez l’autre extrémité sur une surface de travail reliée à une cassette fermée. Effectuez un entraînement à la poutre d’équilibre une semaine avant la chirurgie pour vous assurer que les souris se déplacent en douceur d’un bout à l’autre de la poutre. Considérez qu’une souris a réussi le test lorsqu’elle traverse le faisceau deux fois en 60 secondes sans faire de pause.
Après chaque essai, vaporisez la poutre d’équilibre avec de l’alcool à 75 % pour que l’odeur résiduelle de la souris précédente n’affecte pas la souris suivante. Effectuez le test de la poutre d’équilibre et notez le temps moyen de chaque souris qui passe la poutre d’équilibre deux fois de suite. Et le nombre de fois que le pied arrière droit glisse de la poutre, en tant que variables dépendantes.
Pour l’analyse de l’empreinte, placez un canal en plastique en forme de U sur la table expérimentale et connectez une extrémité du canal en plastique à une cassette fermée. Placez un papier pigmenté uni à plat dans le canal. Ensuite, tenez la souris à deux mains et peignez uniformément les pieds avant et arrière avec un pigment rouge et vert non toxique.
Maintenant, placez la souris peinte à une extrémité du canal et laissez-la se déplacer à l’autre extrémité de la cassette. Prenez le papier pigmenté avec les empreintes, marquez-le et laissez-le sécher dans un espace ventilé et ombragé. Vaporisez le canal en plastique en forme de U avec de l’alcool à 75 % après le passage de chaque souris, pour éviter que l’odeur résiduelle de la souris précédente n’affecte la souris suivante.
Sélectionnez trois empreintes de souris effacées consécutives sur chaque papier. À l’aide d’une règle, mesurez la longueur du pas de l’empreinte du pied droit de la souris, avec la largeur du pas entre les empreintes gauche et droite. Utilisez une pince à épiler microscopique et des ciseaux pour enlever l’excès de tissus mous autour des échantillons de cheville.
Ensuite, placez les échantillons dans un tube à centrifuger contenant une solution de décalcification à 10% d’EDTA et marquez les différents groupes. Ensuite, placez le tube de centrifugation sur une table vibrante pour la décalcification. Changez la solution de décalcification une fois par jour et déterminez la détartrage des échantillons.
Après un mois de décalcification, déshydratez les échantillons avec de l’alcool de gradient, puis utilisez du N-butanol pendant huit heures à des fins de nettoyage. Enfin, immergez les échantillons dégagés dans de la paraffine en position coronale pour l’enrobage. Avant de sectionner, transférer les échantillons du réfrigérateur à quatre degrés Celsius dans un congélateur à moins 20 degrés Celsius pendant environ 10 minutes, pour faciliter la coupe complète des plans.
Fixez les échantillons sur le microtome et sectionnez-les sur une épaisseur de six micromètres. En même temps, utilisez un microscope pour observer si les échantillons ont été coupés au niveau attendu pour faciliter la pénétration d’une aiguille de seringue dans le tissu osseux. Après avoir coupé deux ou trois sections complètes de paraffine d’affilée, transférez-les dans la machine à comprimés, réglées à 40 degrés Celsius, pour une expansion complète.
Retirez ensuite les sections de paraffine à l’aide d’une lame de verre. Enfin, marquez les diapositives avec des groupes et des chiffres. Observer la structure intacte de l’articulation ASCJ au microscope.
Placez les sections dans un incubateur réglé à 60 degrés Celsius pendant 40 à 50 minutes. Ensuite, décérez les sections avec du xylène trois fois, comme décrit dans le manuscrit. Placez les sections déparaffinées dans de l’éthanol à 100 % deux fois pendant trois minutes, suivies de 90 % et d’éthanol à 80 % pendant cinq minutes chacune.
Lavez ensuite les sections avec de l’eau distillée pendant cinq minutes. Après avoir trempé dans de l’hématoxyline pendant une minute, lavez les sections avec de l’eau distillée double jusqu’à ce qu’elles deviennent incolores. Faites tremper les sections dans une solution de différenciation à l’éthanol acide à 1 % pendant 30 secondes et lavez-les avec de l’eau doublement distillée.
Une fois que les sections sont colorées avec une solution d’ammoniac à 1% et lavées avec de l’eau doublement distillée, colorez les échantillons avec une solution de coloration à l’éosine pendant une minute. Et puis mettez-les successivement dans de l’éthanol à 95% et à 100% pendant une minute chacun. Enfin, traitez les sections avec du xylène quatre pendant une minute.
Séchez les sections à l’air libre et couvrez-les d’une lamelle, après avoir collé une goutte de résine neutre sur les échantillons sur les lames. Prenez ensuite des images avec un microscope à fluorescence vertical en fond clair à cinq et 20X. Faites tremper les sections colorées à l’hématoxyline et à l’ammoniac dans un vert rapide à 0,05 % pendant deux minutes.
Ensuite, faites tremper les sections dans une solution d’acide acétique à 1 % pendant 30 secondes et à 0,1 % de safranine pendant cinq minutes. Traitez ensuite les lames avec de l’éthanol et du xylène comme démontré précédemment. Prenez des images avec un microscope à fluorescence vertical en fond clair à 5X et 20X.
Après trois jours, huit semaines et 12 semaines de chirurgie, les groupes ligamentaires sectionnés ont mis beaucoup plus de temps à passer à travers la poutre d’équilibre que le groupe simulé. Avant l’opération, la longueur du pas du pied arrière droit était comparable entre les trois groupes de souris. Cependant, 12 semaines après la chirurgie, la longueur de l’étape était plus courte dans le groupe de coupure ligamentaire que dans le groupe simulé.
Avant la chirurgie, le temps de réponse de nociception thermique des pieds des souris pendant l’activité est similaire chez les trois groupes de souris. Après la chirurgie, les souris du groupe ayant subi une coupure ligamentaire ont montré des temps de réponse plus longs que celles du groupe simulé. L’ASCJ de l’arrière-pied droit dans les groupes de ligaments sectionnés a montré des surfaces rugueuses, une accumulation d’ostéophytes, des changements dégénératifs.
Et une fraction de volume osseux significativement plus élevée que le groupe fictif. La couche cartilagineuse de l’ASCJ dans le groupe de coupure ligamentaire a montré une discontinuité et une diminution du nombre de chondrocytes. De plus, les scores de Malkin et de la Société internationale de recherche sur l’arthrose des souris amputées d’un ligament étaient significativement plus élevés que ceux du groupe fictif.
Le collagène de type 2 dans la couche de cartilage articulaire ASCJ du groupe fictif de l’arrière-pied droit était plus uniforme et plus élevé que celui des deux groupes de souris avec des ligaments sectionnés. Cette étude peut être utilisée pour le diagnostic et les traitements de l’instabilité de la cheville, et fournir une référence expérimentale pour les traitements cliniques de cette maladie.
