Il successo dell'istituzione del modello murino di incapacità ASCJ estende un semplice modello animale di incapacità della caviglia e fornisce nuovi concetti per lo studio delle malattie cliniche del piede. Abbiamo creato un modello animale più in linea con la situazione clinica reale, che può essere utilizzato per ulteriori ricerche sulla diagnosi e il trattamento delle malattie del piede. Una settimana prima dell'esperimento, sottoponi i topi a un allenamento di equilibrio e andatura, passando da un'estremità all'altra di una trave di equilibrio o di un tubo a forma di U, senza fermarsi.
Dopo aver anestetizzato e rimosso i peli sull'articolazione della caviglia degli arti posteriori destri del topo, disinfettare la pelle esposta con un tampone di iodio. Trasferire il topo nella sala operatoria dell'animale di microchirurgia utilizzando un tampone chirurgico sterile. Per i gruppi trasversali del legamento cervicale e del legamento peroneo-astragalico anteriore, praticare un'incisione longitudinale obliqua verso il basso di sette millimetri con un bisturi sulla pelle sopra l'articolazione della caviglia destra.
E sonda con microscopiche pinze diritte nella parte anteriore dell'articolazione della caviglia. Assicurandosi l'esposizione del legamento peroneo-astragalico anteriore al bordo inferiore del corpo astragalico e del perone, tagliarlo delicatamente con un bisturi. Separare i tendini peroneali lunghi e corti e i tendini estensori lunghi delle dita.
Esporre il legamento cervicale e tagliarlo con un bisturi. Per il gruppo legamento cervicale trasverso più legamento deltoide, praticare un'incisione verticale di otto millimetri sulla pelle mediale dell'articolazione della caviglia destra e separare bruscamente il DL dal malleolo mediale per tagliarlo. Quindi tagliare il legamento cervicale come dimostrato in precedenza.
Per il gruppo fittizio, eseguire un intervento chirurgico fittizio sull'articolazione della caviglia destra. Dopo aver lavato l'incisione con soluzione fisiologica normale sterile, suturarla con filo di nylon chirurgico 5-0, seguita dalla disinfezione dell'incisione suturata con un tampone di iodio. Una volta che il gonfiore dell'articolazione angolare si è ridotto a due settimane dall'intervento chirurgico, esercitare i topi nella macchina per la fatica rotante del mouse per un'ora al giorno.
Per il test della trave di equilibrio, clamp una trave di legno circolare inclinata di 15 gradi a un'estremità con una clip per treppiede fotografico e posizionare l'altra estremità su una superficie di lavoro collegata a una cassetta chiusa. Eseguire l'allenamento del fascio di equilibrio una settimana prima dell'intervento chirurgico per assicurarsi che i topi si muovano agevolmente da un'estremità all'altra del fascio. Si consideri che un topo ha superato il test quando passa attraverso il raggio due volte in 60 secondi senza fermarsi.
Dopo ogni prova, spruzzare il bilanciere con alcol al 75% per presentare l'odore residuo del topo precedente che influisce sul topo successivo. Eseguire il test della trave di bilanciamento e registrare il tempo medio di passaggio di ciascun mouse sulla trave di equilibrio due volte di seguito. E il numero di volte in cui il piede posteriore destro scivola fuori dalla trave, come variabili dipendenti.
Per l'analisi dell'impronta, posizionare un canale di plastica a forma di U sul tavolo sperimentale e collegare un'estremità del canale di plastica a una cassetta chiusa. Posiziona una carta pigmentata semplice nel canale. Quindi tieni il mouse con entrambe le mani e dipingi i piedi anteriori e posteriori in modo uniforme con pigmento rosso e verde non tossico.
Ora, posiziona il mouse dipinto a un'estremità del canale e lascialo spostare all'altra estremità della cassetta. Prendete la carta pigmentata con le impronte, segnatela e lasciatela asciugare in uno spazio ventilato e ombreggiato. Spruzzare il canale di plastica a forma di U con alcol al 75% dopo che ogni topo è passato, per evitare che l'odore residuo del topo precedente influisca sul topo successivo.
Selezionare tre impronte di topo chiare consecutive su ciascun foglio. Usando un righello, misura la lunghezza del passo dell'impronta del piede destro del mouse, con la larghezza del passo tra le impronte sinistra e destra. Usa pinzette e forbici microscopiche per rimuovere i tessuti molli in eccesso intorno ai campioni di caviglia.
Quindi, posizionare i campioni in una provetta da centrifuga contenente una soluzione di decalcificazione EDTA al 10% e contrassegnare i diversi gruppi. Quindi, posizionare la provetta da centrifuga su un tavolo vibrante per la decalcificazione. Cambiare la soluzione di decalcificazione una volta al giorno e determinare la decalcificazione dei campioni.
Dopo un mese di decalcificazione, disidratare i campioni con alcool a gradiente, quindi utilizzare l'N-butanolo per otto ore a scopo di pulizia. Infine, immergere i campioni eliminati in paraffina in posizione coronale per l'inclusione. Prima del sezionamento, trasferire i campioni dal frigorifero a quattro gradi Celsius a un congelatore a meno 20 gradi Celsius per circa 10 minuti, per facilitare il taglio completo dei piani.
Fissare i campioni sul microtomo e sezionarli in uno spessore di sei micrometri. Allo stesso tempo, utilizzare un microscopio per osservare se i campioni sono stati tagliati al livello previsto per una facile penetrazione dell'ago di una siringa nel tessuto osseo. Dopo aver tagliato due o tre sezioni complete di paraffina in fila, trasferirle nella macchina per compresse, impostata a 40 gradi Celsius, per un'espansione completa.
Quindi rimuovere le sezioni di paraffina con un vetrino. Infine, contrassegna le diapositive con gruppi e numeri. Osservare al microscopio la struttura intatta dell'articolazione ASCJ.
Mettere le sezioni in un'incubatrice a 60 gradi Celsius per 40-50 minuti. Quindi decerare le sezioni con xilene tre volte, come descritto nel manoscritto. Mettere le sezioni decerate in etanolo al 100% due volte per tre minuti, seguite da etanolo al 90% e all'80% per cinque minuti ciascuna.
Quindi lavare le sezioni con acqua bidistillata per cinque minuti. Dopo l'ammollo in ematossilina per un minuto, lavare le sezioni con acqua bidistillata fino a quando non diventano incolori. Immergere le sezioni in una soluzione di differenziazione dell'etanolo acido all'1% per 30 secondi e lavarle con acqua bidistillata.
Una volta che le sezioni sono state colorate con una soluzione di ammoniaca all'1% e lavate con acqua bidistillata, colorare i campioni con una soluzione colorante di eosina per un minuto. E poi metterli in 95% e 100% di etanolo in successione per un minuto ciascuno. Infine, trattare le sezioni con xilene quattro per un minuto.
Asciugare le sezioni all'aria e coprirle con un vetrino coprioggetto, dopo aver incollato una goccia di resina neutra sui campioni sui vetrini. Quindi scatta immagini con un microscopio a fluorescenza verticale in campo chiaro a cinque e 20X. Immergere le sezioni macchiate di ematossilina e ammoniaca in verde rapido allo 0,05% per due minuti.
Successivamente immergere le sezioni in una soluzione di acido acetico all'1% per 30 secondi e in safranina allo 0,1% per cinque minuti. Quindi trattare i vetrini con etanolo e xilene come dimostrato in precedenza. Scatta immagini con un microscopio a fluorescenza verticale in campo chiaro a 5X e 20X.
Dopo tre giorni, otto settimane e 12 settimane di intervento chirurgico, i gruppi legamentosi recisi hanno impiegato molto più tempo a passare attraverso la trave di equilibrio rispetto al gruppo fittizio. Prima dell'intervento chirurgico, la lunghezza del passo del piede posteriore destro era paragonabile tra i tre gruppi di topi. Tuttavia, 12 settimane dopo l'intervento chirurgico, la lunghezza del passo era più breve nel gruppo con taglio dei legamenti rispetto al gruppo fittizio.
Prima dell'intervento chirurgico, il tempo di risposta alla nocicezione termica dei piedi dei topi durante l'attività è simile tra i tre gruppi di topi. Dopo l'intervento chirurgico, i topi nel gruppo con taglio dei legamenti hanno mostrato tempi di risposta più lunghi rispetto al gruppo fittizio. L'ASCJ del piede posteriore destro nei gruppi legamentosi recisi ha mostrato superfici ruvide, accumulo di osteofiti, alterazioni degenerative.
E una frazione di volume osseo significativamente più alta rispetto al gruppo fittizio. Lo strato di cartilagine dell'ASCJ nel gruppo di taglio dei legamenti ha mostrato discontinuità e diminuzione del numero di condrociti. Inoltre, i punteggi di Malkin e Osteoarthritis Research Society International dei topi con amputazione dei legamenti erano significativamente più alti rispetto al gruppo fittizio.
Il collagene di tipo due nello strato di cartilagine articolare ASCJ del gruppo fittizio del piede posteriore destro era più uniforme e superiore a quello dei due gruppi di topi con legamenti recisi. Questo studio può essere utilizzato per la diagnosi e i trattamenti per l'instabilità della caviglia, e fornire un riferimento sperimentale per i trattamenti clinici di questa malattia.
