פרוטוקול זה משמעותי מכיוון שהוא מציג לולאות כרומוזומים ברזולוציה גבוהה ותכונות אינטראקציה קצרות טווח אחרות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא מיפוי של ארגון הגנום התלת-ממדי ברזולוציית נוקלאוזומים עם יחס אות לרעש גבוה. כדי לבצע את הטיטרציה MNase, הפשיר גלולה אחת של אחד כפול 10 לתאים השישיים על קרח במשך 10 דקות, והשהה מחדש את התאים ב 500 מיקרוליטר של DPBS, ודגר על תרחיף התא על קרח במשך 20 דקות.
לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב 10, 000 גרם במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר ולהסיר את supernatant. להשהות מחדש את התאים הכדוריים ב 500 מיקרוליטר של MB מאגר מספר אחד. הפשירו בקבוקון אחד של 20 יחידות למיקרוליטר MNase, ודללו אותו ב-10 מילימולר טריס לתנאי העיכול כמתואר בטקסט.
עם מרווחי זמן מתאימים של 10 עד 20 שניות, הוסף מיקרוליטר אחד של תמיסת העיכול MNase הראשונה לאחת מארבע צינוריות הדגימות, מערבולת ודגור ב- ThermoMixer ב- 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ב- 800 סל"ד. המשך להוסיף מיקרוליטר אחד מדילולי MNase הנותרים לאליציטוטים התא האחרים. עצור את עיכול MNase על ידי הוספת 200 מיקרוליטר של חיץ עצירה טרי מוכן לכל צינור באותו סדר ובאותו מרווח זמן שבו MNase נוסף.
דוגרים בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. הוסף 500 מיקרוליטר PCI לכל דגימה, וערבב היטב על ידי מערבולת. צנטריפוגה ב 19, 800 גרם במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי להפריד את השלבים.
ולהעביר את הפאזה המימית לצינורות חדשים. לטהר את הדנ"א באמצעות ערכת טיהור DNA מסחרית בהתאם להוראות היצרן, ולחקות את הדגימות ב-12 מיקרוליטר של חיץ אלוציה. הוסיפו שניים עד חמישה מיקרוליטרים של צבע העמסה לדגימת הדנ"א המטוהר.
הפעל את הדגימות על ג'ל אגרוז 1.5%, ובחר את מידת העיכול הטובה ביותר עבור הניסוי. דרגת עיכול אופטימלית מציגה מעט מאוד מקטעים תת-נוקלאוזומליים אם בכלל, ויחס מונו לדינוקלאוזומים של 70% עד 90%. במדגם מייצג זה נבחרה דרגת עיכול בינונית בין נתיבים שלוש וארבע לניסויי המשך.
בהתבסס על טיטרציה MNase, לעכל את הכרומטין על ידי הוספת כמות מתאימה של MNase לכל aliquot דגימה. מערבבים היטב ודגרים ב-ThermoMixer בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 800 סל"ד למשך 10 דקות. לעצור את העיכול MNase על ידי הוספת 1.6 מיקרוליטר של 0.5 EGTA מולארי לכל aliquot, ולדגור ב ThermoMixer ב 65 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות עם 800 סל"ד רעד.
לאסוף את הדגימה על ידי צנטריפוגה ב 10, 000 G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, ולהשליך את supernatant. להשהות מחדש את גלולת התא ב 500 מיקרוליטר של 1X NEB חיץ 2.1. דגימות מאגר שוות ערך לקלט של חמש כפול 10 לתא השישי או פחות לעיבוד נוסף.
לפני שתמשיך לקשירת הקרבה, העבר 10% מהמדגם כבקרת קלט כדי לפקח על רמת העיכול של MNase. הוסף 150 מיקרוליטר של 10 מילימולר טריס, 25 מיקרוליטר של 10% SDS, ו 25 מיקרוליטר של 20 מיליגרם למיליליטר פרוטאינאז K לבקרת העיכול, ודגור לילה על 65 מעלות צלזיוס. לאסוף את הדגימה הנותרת על ידי צנטריפוגה ב 10, 000 גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס ולהשליך את supernatant.
משעים מחדש את הגלולה ב-90 מיקרוליטר של תערובת מאסטר מיקרו-C טרייה, ודגרים ב-ThermoMixer בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 800 סל"ד למשך 15 דקות. מוסיפים 10 מיקרוליטר של חמש יחידות לשבר קלנוב מיקרוליטר ודגרים בתרמומיקסר. לאחר מכן להוסיף 100 מיקרוליטר של מיקרו-C טרי מוכן מאסטר לערבב שניים.
דוגרים במשך 45 דקות ב-25 מעלות צלזיוס, 800 סל"ד, ומרווים את התגובה האנזימטית עם EDTA כמתואר בטקסט. דוגרים במיקסר תרמי למשך 20 דקות בחום של 65 מעלות, 800 סל"ד. לאסוף את הדגימה על ידי צנטריפוגה ב 10, 000 גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס, ולהשליך את supernatant.
יש להשהות מחדש את הדגימה ב-500 מיקרוליטר של תערובת מאסטר טרייה של מיקרו-C, ולדגור במשך 2.5 שעות בטמפרטורת החדר ב-15 עד 20 סל"ד. חזור על הצנטריפוגה והסר את הסופרנטנט. לאחר מכן יש להשהות מחדש את הדגימה ב-200 מיקרוליטר של תערובת מאסטר טרייה של מיקרו-C ארבע, ולדגור ב-ThermoMixer בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ב-800 סל"ד.
עבור קישור צולב הפוך ודה-פרוטאינציה, יש להוסיף 25 מיקרוליטר של 20 מיליגרם למיקרוליטר פרוטאינאז K ו-25 מיקרוליטר של 10% SDS לדגימה, ולדגור בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך הלילה בערבוב לסירוגין. הוסף 500 מיקרוליטר PCI לדגימות ולבקרת הקלט, ולאחר מכן ערבב על ידי מערבולת. מפרידים את השלבים על ידי צנטריפוגה ב 19, 800 G למשך חמש דקות, ומעבירים את השלב המימי העליון לצינור טרי.
לרכז את הדנ"א ולבודד את הדגימות ב 30 מיקרוליטר, ואת בקרת הקלט ב 15 מיקרוליטר. יש להשתמש בג'ל אגרוז 1.5% כדי להפריד את המונונוקלאוזומים והדי-נוקלאוזומים. הבלו את מקטעי הדנ"א בעלי גודל דינוקלאוזומי, ומוציאים את הדנ"א כמתואר בטקסט.
מוסיפים 150 מיקרוליטר חרוזים מוכנים מראש ל-150 מיקרוליטר של הדגימה, ודגרים בטמפרטורת החדר. הניחו את הצינורות במגנט מתאים והמתינו עד שהתמיסה תתבהר. הסר את supernatant ו resuspend את החרוזים ב 300 מיקרוליטר של 1X TBW, ולחזור על שלב זה.
חזור על ההפרדה המגנטית, ולאחר שהתמיסה מתבהרת, הסר את הסופרנאטנט והשהה מחדש את החרוזים ב -100 מיקרוליטר של 0.1X TE. חזור על הפעולה והשהה מחדש ב 50 מיקרוליטר של 0.1X TE. להעביר את הפתרון צינורות PCR ולבצע מניפולציה DNA כמתואר בטקסט. לאחר השלמת קשירת המתאם, שטפו את הדגימה ב-1X TBW, השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את החרוזים ב-20 מיקרוליטר של 0.1X TE. מטב את מספר מחזורי PCR והגבר את ספריות הרצפים כמתואר בטקסט. כרומטין מ 250, 000 תאים לכל תגובה התעכל עם דילול פי ארבעה של MNase.
הריכוז הגבוה ביותר, 10 יחידות, הראה כרומטין מעוכל יתר על המידה המורכב כמעט אך ורק מ- DNA מונונוקלאוזולי. העיכול של 250, 000 תאי ES עכבר עם 0.625 יחידות של MNase הציע את נקודת ההתחלה המבטיחה ביותר לעיכול מוכן בניסויי Micro-C. עם זאת, יש לשקול ריכוז MNase ביניים בין התנאים המוצגים בנתיבים שלוש וארבע, המקביל לחמש יחידות לכל מיליון תאים.
לרצועה המונונוקלאוזומית המקושרת הייתה גודל משוער של 300 זוגות בסיסים, בדומה לזה של דינוקלאוזומים. לכן, יחס אות הפס מונו לדינוקלאוזומים השתנה ממונונוקלאוזומים בעיקר לכיוון דינוקלאוזומים. האיכות והכמות של ספריית הריצוף שהוכנה הוערכו באמצעות PCR מינימלי.
תצוגה חזותית הראתה פס אחד מובחן ב- 420 זוגות בסיסים, וללא רצועות עבור דימרים של מתאמים. בעוד ששתי הדגימות במחקר זה הציגו שיעורי מפות גבוהים, במדגם הטוב היה שיעור גבוה יותר של קריאות סיס. שיעור גבוה של אינטראקציות טרנס-כרומוזומליות מצביע על אירועי קשירה אקראיים, אם כי חלק מהאינטראקציות הטרנס-כרומוזומליות עשויות להיות חשובות.
בנוסף, במדגם הטוב היה שיעור מתון של זוגות קריאה של מיפוי קדימה-אחורה, עם מרחקים קטנים מ-500 זוגות בסיסים. זה הצביע על שיעור נמוך של דינוקלאוזומים שלא נבקעו על ידי MNase בגודל דומה לשני נוקלאוזומים קשורים. דרגת עיכול MNase תקינה חיונית לניסוי זה.
נוקלאוזומים מעוכלים יתר על המידה קשורים בצורה לא יעילה, ובכרומטין לא מעוכל יש חלק גדול של דינוקלאוזומים לא מעוכלים שיכולים לזהם את ספריית הריצוף. ניתן לשלב מיקרו-C עם גישת לכידה למיפוי ארגון גנום ספציפי ללוקוס ברזולוציה גבוהה מאוד.
