هذا البروتوكول هو المفتاح لتوليد سلالات يمكن استخدامها في فحوصات الفحص عالية الإنتاجية لتقييم النشاط المحتمل والتقليدي للجزيئات سيتم توضيح الإجراء من قبل خوانا كوينتيرو ولورا بينيدا ، مساعدي الأبحاث من مختبري. للبدء ، قم بتضخيم الجين المستهدف باستخدام بوليميراز عالي الدقة للحفاظ على تسلسل الترميز. أضف البادئات إلى مزيج التفاعل بتركيز نهائي قدره 0.2 ميكرومولار وقم بتشغيل بروتوكول دورة PCR كما هو موضح في المخطوطة.
قم بتنقية جزء تفاعل البوليميراز المتسلسل المضخم باستخدام مجموعة تنقية منتج PCR التقليدية. لتقليم نهايات منتج eGFP PCR ، قم بإعداد تفاعل مع إنزيم Kpn I وفقا لتعليمات الشركة المصنعة واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. ثم أضف 100 ملليمولار من كلوريد الصوديوم و 10 وحدات من Bgl II إلى التفاعل واحتضانها لمدة 15 دقيقة.
بعد الهضم ، قم بتنقية التفاعل كما هو موضح سابقا. بعد ذلك ، هضم متجه تعبير pLEXSY مع Bgl II و Kpl I بعد الهضم المتسلسل كما هو موضح سابقا. ربط 100 نانوجرام من ناقل pLEXSY المهضوم و 28 نانوجرام من eGFP المهضوم في تفاعل 20 ميكرولتر يحتوي على مخزن مؤقت للربط وثلاث وحدات من T4 DNA ligase.
احتضان بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. في نهاية الحضانة ، قم بتحويل خلايا الإشريكية القولونية المختصة بمنتج الربط باستخدام بروتوكولات التحويل القياسية. صفيحة الخلايا المحولة في أجار الأمبيسلين LB واحتضانها لمدة 24 ساعة عند 30 درجة مئوية لاختيار الحيوانات المستنسخة المؤتلفة.
بعد فحص المستعمرات ، قم بتنقية الحمض النووي للبلازميد من استنساخ إيجابي لنقله لاحقا باستخدام مجموعة عزل البلازميد التجارية. لإنتاج شظايا خطية من البلازميد ، خذ ما لا يقل عن 10 ميكروغرام من بلازميد pLEXSY eGFP المنقى وهضمه باستخدام SWA1 لمدة ثلاث إلى أربع ساعات عند 25 درجة مئوية. في نهاية الحضانة ، تعطل الحرارة منتج الهضم عند 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
ثم قم بتشغيل منتج الهضم في هلام الأغاروز الكهربائي لفصل الأجزاء الناتجة. قم بتنقية كاسيت التعبير باستخدام مجموعة استخراج جل الأغاروز التجارية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تنمو الثقافات الطفيلية حتى يكون هناك ما يكفي من مرحلة السجل أو promastigotes المرحلة الثابتة المبكرة.
قم بتجميع محتويات قوارير الثقافة المتعددة إذا لزم الأمر. أجهزة الطرد المركزي ثقافة الطفيليات في 2،000 غرام لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. أعد تعليق الحبيبات في محلول التثقيب الكهربائي عند أربع درجات مئوية للحصول على تركيز واحد في 10 أس ثامن من الطفيليات لكل ملليلتر واحتفظ بها على الجليد لمدة 10 دقائق.
في الوقت نفسه ، يتم بناء أنابيب ما قبل التبريد التي تحتوي على 2 إلى 10 ميكروغرام من pLEXSY eGFP الخطي في 50 ميكرولتر من الماء أو 10 ملليمولار تريس عازلة مع درجة الحموضة 8.0 و cuvettes التثقيب الكهربائي بقطر 2 ملم. بعد ذلك ، أضف 350 ميكرولترا من الطفيليات المبردة مسبقا إلى الأنبوب باستخدام البلازميد الخطي وانقل 400 ميكرولتر بالكامل إلى كوفيت التثقيب الكهربائي على الجليد. إلكتروبور الخلايا الطفيلية مع البلازميد وبالتوازي ، خلايا الطفيليات دون الحمض النووي البلازميد كعنصر تحكم سلبي.
ضع كوفيت على الجليد لمدة 10 دقائق. نقل الطفيليات بالكهرباء إلى خمسة ملليلتر من وسط الاستزراع المناسب واحتضانها عند 26 درجة مئوية لمدة 20 ساعة. بعد حوالي 20 ساعة من التثقيب الكهربائي ، راقب الثقافات تحت المجهر وأضف المضاد الحيوي الانتقائي المناسب اعتمادا على بلازميد pLEXSY المستخدم.
اتبع الثقافات مجهريا حتى يكون هناك فرق واضح بين الطفيليات المكهربة مع وبدون الحمض النووي البلازميد. للتحقق من مضان الطفيليات من خلال قياس التدفق الخلوي ، يقوم جهاز الطرد المركزي بواحد ملليلتر من ثقافة الطور الثابت عند 2،000 جم لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد غسل الخلايا مرتين في برنامج تلفزيوني ، أعد تعليق الحبيبات النهائية في ملليلتر واحد من PBS.
قم بتشغيل العينات وجمع 20،000 حدث بسرعة 0.5 ميكرولتر في الثانية. قم بتعيين قيم الكسب لقنوات التشتت الأمامي والتشتت الجانبي ومضان واحد مثل 225.0 و 200.0 و 520.0 على التوالي. إنشاء بوابة G1 تحتوي على السكان الطفيليات.
قم بتصفية قناة FL1 من خلال تلك البوابة لتحديد التألق الذاتي ل promastigotes وقم بتعيين بوابة نطاق G2 لقناة FL1. قم بتشغيل الطفيليات المنقولة للتحقق مما إذا كان هناك مضان. سجل النسبة المئوية للطفيليات في G1 الفلورية ومتوسط شدة التألق في G2. تنقية الحمض النووي الجينومي من 2 إلى 5 ملليلتر من ثقافة طفيلي المرحلة الثابتة عن طريق استخراج كلوروفورم الفينول التقليدي أو باستخدام مجموعة تجارية.
قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل التشخيصي ل pLEXSY-sat2.1 باستخدام بروتوكول ركوب الدراجات كما هو موضح في المخطوطة. بعد تأكيد التألق من خلال قياس التدفق الخلوي ، قم بإعداد تخفيف الطفيليات المؤتلفة بتركيز خمسة promastigotes لكل ملليلتر. أضف 100 ميكرولتر من هذا التخفيف إلى كل بئر من لوحة 96 بئرا واترك اللوحة دون إزعاج لمدة 12 ساعة على الأقل.
اتبع اللوحة مجهريا عند تكبير لا يقل عن 100X حتى يتم اكتشاف الآبار ذات نمو الطفيليات. عندما يكون البئر مليئا بالطفيليات ، استخدم المحتوى لتلقيح ثقافة خمسة ملليلترات. بمجرد وصول الثقافات المستنسخة إلى المرحلة الثابتة ، تحقق من التألق باستخدام قياس التدفق الخلوي كما هو موضح سابقا.
حدد الحيوانات المستنسخة التي تحتوي على 98٪ إلى 99٪ من الطفيليات الفلورية وأعلى متوسط كثافة مضان للمقايسات في المختبر وفي الجسم الحي. مستعمرة PCR لخلايا E.coli التي تم تحويلها باستخدام بنية pLEXSY eGFP ولدت منتج زوج قاعدة 859. أدى الهضم الكلي للبلازميد باستخدام SWA1 إلى شظيتين ، جزء زوج 2.9 كيلو قاعدة يحتوي على جميع العناصر اللازمة للتكرار والاختيار في E.coli وجزء زوج من سبعة إلى ثمانية كيلوبيس يمثل شريط التعبير الخطي المستخدم في النقل.
كشف تحليل قياس التدفق الخلوي أن 82٪ من طفيليات L.panamensis المنقولة عبرت عن eGFP. بعد الانتقاء متعدد النسيلة ، كانت 98.44٪ من طفيليات L.donovani التي تم تحليلها بواسطة قياس التدفق الخلوي فلورية مقارنة ب 82.0٪ من L.panamensis. أدى التكامل الناجح ل pLEXSY eGFP في موضع SSU إلى منتج زوج 2.3 كيلو قاعدة في تفاعل البوليميراز المتسلسل التشخيصي.
تم اختيار الحيوانات المستنسخة التي تحتوي على أعلى نسبة من الطفيليات الفلورية ومتوسط كثافة التألق لاستخدامها مرة أخرى في فحوصات فحص الأدوية. تسمح هذه الطريقة بإنتاج طفيليات الليشمانيا المؤتلفة مع
