ويمثل البروتوكول خطوة هامة لوضع ذبابة الفاكهة كنموذج موحد لاختبار السلامة الكيميائية ولوضع منهجيات نهج جديدة تسمى عادة NAMs. يصف البروتوكول طريقة فعالة وغير مكلفة تستخدم الوسائط السائلة لتقييم تأثيرات المواد السامة الكيميائية على صلاحية ذبابة الفاكهة الميلانية البالغة. ابدأ بتكديس أربع أوراق من ورق كروماتوغرافيا السليلوز من الدرجة الأولى وتقطيعها إلى شرائح بعرض بوصتين.
قم بإدخال ورق ترشيح على شكل زهرة باستخدام لكمة ورقية مقاس 1.5 بوصة تحتوي على صبغة على شكل زهرة. ادفع كومة ورق الترشيح إلى أسفل قارورة بولي بروبيلين قطرها 28.5 مم باستخدام وتد خشبي غير مصقول مقاس 22 × 220 ملم. تأكد من أن المكدس يقع بشكل آمن في الجزء السفلي من القارورة.
قم بتخزين القوارير المعدة في صواني بلاستيكية أو من الورق المقوى وضع الصواني في أكياس بلاستيكية كبيرة حتى الاستخدام. افتح القارورة الزجاجية التي تحتوي على الذباب ، وضعها على فم القارورة البلاستيكية المعدة وانقل الذباب المطابق للجنس المصنف إلى قارورة الجوع عن طريق النقر على الجزء السفلي من القارورة البلاستيكية على سطح الطاولة. أغلق القارورة البلاستيكية بسدادة أسيتات السليلوز أو flug وسجل أي ذباب مفقود في هذا النقل.
بمناسبة قوارير الجوع التي تحتوي على الذباب الإناث مع شريط. لتجنب الاختلاط العرضي ، اترك القوارير مع ذباب البريد بدون علامات. جهز غرفة الرطوبة للتعرض طوال الليل عن طريق وضع ستة مناشف ورقية قياسية في الأسفل.
ثم انقع المناشف الورقية ب 100 مل من الماء وضع الشبكة البلاستيكية فوق المناشف المبللة لضمان عدم ملامسة القوارير للمناشف الورقية المشبعة. بعد وضع صواني قوارير الجوع في وضع أفقي داخل غرفة الرطوبة ، قم بنقل غرفة الرطوبة إلى حاضنة 25 درجة مئوية للحضانة طوال الليل. لتحضير قوارير التعرض للمواد الكيميائية ، انقل أربع قوارير من إناث الذباب الجائعة تحتوي على 20 ذبابة لكل قارورة إلى أربع قوارير تعرض لكل تركيز كيميائي.
تسمية هذه القوارير على أنها أنثى. تحضير قوارير التعرض للمواد الكيميائية التي تحتوي على صبغة زرقاء عن طريق نقل قارورة من إناث الذباب الجائعة إلى قارورة تعرض زرقاء لكل تركيز كيميائي. تسمية هذه القارورة على أنها أنثى.
سجل عدد الذباب الموجود في كل قارورة بعد النقل ولاحظ العدد الذي مات أو هرب. عادة ، يجب أن تنجو جميع الذباب ال 20 من الجوع والنقل بين عشية وضحاها. ضع قوارير التعرض أفقيا في غرفة رطوبة معدة حديثا قبل وضع الحجرة في حاضنة 25 درجة مئوية مع رطوبة 60٪ تقريبا و 12 إلى 12 ساعة من الضوء إلى دورة مظلمة.
افحص قوارير التعرض بعد 24 و 48 ساعة من بدء التعرض للمواد الكيميائية. عد وسجل الذباب الميت في كل قارورة في كل نقطة زمنية. لتحديد ما إذا كان الذباب المكشوف قد استهلك وسط التعرض الأزرق في قوارير التعرض الزرقاء بعد 24 ساعة من التعرض الكيميائي ، افحص جدران القارورة بحثا عن مؤشرات البراز الأزرق الذي يظهر كنقاط صغيرة على جانب قارورة التعرض والتدفق.
بعد ذلك ، قم بتخدير الذباب باستخدام ثاني أكسيد الكربون قبل فحص البطن بحثا عن وجود صبغة زرقاء. افحص الذباب بحثا عن سلوكيات التغذية غير الطبيعية مثل القلس وانتفاخ المحاصيل وانهيار وظيفة الحاجز المعوي. بمجرد الانتهاء من ذلك ، تخلص من جميع القوارير الملوثة وورق الترشيح والمقابس والذباب في حاويات النفايات الكيميائية المناسبة.
إذا بقي الذباب الحي في القنينات ، فقم بتجميد القوارير قبل التخلص منها في حاوية النفايات المناسبة. تم تحديد فعالية البروتوكول عن طريق تعريض الأعضاء البالغة أو الذباب الذكري والأنثوي لنطاق تركيزات أرسونيت الصوديوم من صفر إلى مليمولار لتسجيل الفتك بعد 48 ساعة من التعرض. في التجارب اللاحقة ، تم اختيار تركيزات من صفر إلى خمسة مليمولار تحدد بدقة أكبر منحنى استجابة جرعة أرسونيت الصوديوم.
بناء على هذا النموذج ، كانت الجرعة المميتة النهائية ، أو LD 10 و LD 25 و LD 50 من ذكور الذباب التي تغذت على أرسونيت الصوديوم 0.30 مللي مولار و 0.50 مليمولار و 0.65 مليمولار على التوالي. كانت هذه القيم أعلى قليلا بالنسبة لإناث الذباب مع LD 10 من 0.30 مليمولار ، و LD 25 من 0.65 مليمولار و LD 50 من 0.90 مليمولار. في ذكور وإناث الذباب الذي تم تغذيته ب 1٪ F D و C أزرق يحتوي على محاليل أرسونيت الصوديوم ، تم تقيؤ الطعام المبتلع أحيانا بجرعات أعلى من 0.2 مليمولار للإناث و 0.5 مليمولار للذكور ، مما يشير إلى أن القلس يمكن أن يلعب الدور الرئيسي في استجابة خبث الفيليا للتسمم بالزرنيخ.
باتباع بروتوكول التعرض هذا ، يمكن جمع الذباب بسهولة لمزيد من التحليل ، بما في ذلك الدراسات الجينومية والأيضية. هذا البروتوكول هو الخطوة الأولى في إنشاء ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة كنموذج وراثي شائع لإجراء دراسات واسعة النطاق لعلم السموم الدقيق.
