Il protocollo rappresenta un passo importante per stabilire la drosophila come modello standard per i test di sicurezza chimica e per lo sviluppo di nuove metodologie di approccio comunemente chiamate NAM. Il protocollo descrive un metodo efficiente e poco costoso che utilizza mezzi liquidi per valutare gli effetti di una sostanza chimica tossica sulla vitalità della drosophila melanogaster adulta. Inizia impilando quattro fogli di carta cromatografica di cellulosa di grado uno e tagliandoli in strisce larghe due pollici.
Perforare gli inserti di carta da filtro a forma di fiore utilizzando un punzone di carta da 1,5 pollici contenente un colorante a forma di fiore. Spingere la pila di carta da filtro sul fondo di una fiala di polipropilene di 28,5 millimetri di diametro utilizzando un tassello di legno non verniciato da 22 x 220 millimetri. Assicurarsi che la pila sia posizionata saldamente nella parte inferiore del flaconcino.
Conservare i flaconcini preparati in vassoi di plastica o cartone e posizionare i vassoi in grandi sacchetti di plastica fino all'uso. Aprire il flaconcino di vetro contenente le mosche, posizionarlo sulla bocca del flaconcino di plastica preparato e trasferire le mosche abbinate al sesso ordinato alla fiala di fame picchiettando il fondo della fiala di plastica contro un banco. Chiudere la fiala di plastica con un tappo di acetato di cellulosa o un colpo di fortuna e registrare eventuali mosche perse in questo trasferimento.
Segna le fiale di fame contenenti mosche femmine con una striscia. Per evitare la miscelazione accidentale, lasciare i flaconcini con le mosche postali non contrassegnate. Preparare la camera di umidità per l'esposizione notturna posizionando sei tovaglioli di carta standard sul fondo.
Quindi immergere i tovaglioli di carta con 100 millilitri di acqua e posizionare la griglia di plastica sopra gli asciugamani bagnati per assicurarsi che le fiale non entrino in contatto con gli asciugamani di carta saturi. Dopo aver posizionato i vassoi delle fiale di fame in posizione orizzontale all'interno della camera di umidità, trasferire la camera di umidità in un'incubatrice a 25 gradi Celsius per l'incubazione notturna. Per preparare i flaconcini di esposizione chimica, trasferire quattro flaconcini di moscerini femmina affamati contenenti 20 moscerini per flaconcino a quattro flaconcini di esposizione di ciascuna concentrazione chimica.
Etichettare questi flaconcini come femminili. Preparare flaconcini di esposizione chimica contenenti colorante blu trasferendo una fiala di mosche femmine affamate in una fiala di esposizione blu per ogni concentrazione chimica. Etichettare questo flaconcino come femmina.
Registrare il numero di mosche presenti in ogni fiala dopo il trasferimento e annotare il numero di mosche morte o fuggite. Normalmente, tutte e 20 le mosche dovrebbero sopravvivere durante la notte alla fame e al trasferimento. Posizionare i flaconcini di esposizione orizzontalmente in una camera di umidità appena preparata prima di posizionare la camera in un'incubatrice a 25 gradi Celsius con circa il 60% di umidità e un ciclo di luce da 12 a 12 ore è al buio.
Esaminare i flaconcini di esposizione 24 e 48 ore dopo l'inizio dell'esposizione chimica. Contare e registrare le mosche morte in ogni fiala in ogni punto temporale. Per determinare se le mosche esposte hanno consumato i mezzi di esposizione blu nelle fiale di esposizione blu dopo 24 ore dall'esposizione chimica, esaminare le pareti del flaconcino per le indicazioni di feci blu che appaiono come piccoli punti sul lato della fiala di esposizione e del flug.
Quindi, anestetizzare le mosche usando anidride carbonica prima di esaminare gli addomi per la presenza di colorante blu. Esaminare le mosche per comportamenti alimentari anormali come rigurgito, distensione delle colture e rottura della funzione di barriera intestinale. Una volta fatto, gettare tutte le fiale contaminate, la carta da filtro, i tappi e le mosche negli appositi contenitori di rifiuti chimici.
Se le mosche vive rimangono nelle fiale, congelare le fiale prima di gettarle nell'apposito contenitore dei rifiuti. L'efficacia del protocollo è stata determinata esponendo organi adulti o moscerini maschi e femmine all'intervallo di concentrazioni di arsonite di sodio da zero a due millimolari per segnare la letalità dopo 48 ore di esposizione. Negli esperimenti successivi, sono state selezionate da zero a cinque concentrazioni millimolari che hanno definito più precisamente la curva di risposta alla dose di arsonite di sodio.
Sulla base di questo modello, la dose letale finale, o LD 10, LD 25 e LD 50 di moscerini maschi alimentati con incendio di sodio erano rispettivamente 0,30 millimolari, 0,50 millimolari e 0,65 millimolari. Questi valori erano leggermente più alti per le mosche femmine con una LD 10 di 0,30 millimolare, una LD 25 di 0,65 millimolare e una LD 50 di 0,90 millimolare. Nei moscerini maschi e femmine alimentati con soluzioni di arsonite di sodio contenenti blu 1% F e C, il cibo ingerito è stato occasionalmente rigurgitato a dosi superiori a 0,2 millimolari per le femmine e 0,5 millimolari per i maschi, suggerendo che il rigurgito potrebbe svolgere il ruolo chiave nella risposta della filia delle scorie all'avvelenamento da arsenico.
Seguendo questo protocollo di esposizione, le mosche possono essere facilmente raccolte per ulteriori analisi, compresi studi genomici e metabolomici. Questo protocollo è il primo passo per stabilire il moscerino della frutta Drosophila melanogaster come modello genetico comune per condurre studi su larga scala di tossicologia di precisione.
