Le protocole représente une étape importante pour établir la drosophile en tant que modèle standard pour les essais de sécurité chimique et pour développer de nouvelles méthodologies d’approche communément appelées MNA. Le protocole décrit une méthode efficace et peu coûteuse qui utilise des milieux liquides pour évaluer les effets toxiques d’un produit chimique sur la viabilité de la drosophile melanogaster adulte. Commencez par empiler quatre feuilles de papier de chromatographie cellulosique de première qualité et coupez-les en bandes de deux pouces de largeur.
Percer les inserts en papier filtre en forme de fleur à l’aide d’un poinçon en papier de 1,5 pouce contenant un colorant en forme de fleur. Poussez la pile de papier filtre au fond d’un flacon en polypropylène de 28,5 millimètres de diamètre à l’aide d’une cheville en bois non vernie de 22 par 220 millimètres. Assurez-vous que la pile est bien placée au fond du flacon.
Conservez les flacons préparés dans des plateaux en plastique ou en carton et placez-les dans de grands sacs en plastique jusqu’à utilisation. Ouvrez le flacon en verre contenant les mouches, placez-le sur la bouche du flacon en plastique préparé et transférez les mouches triées et appariées au sexe dans le flacon de famine en tapotant le fond du flacon en plastique contre un dessus de paillasse. Fermez le flacon en plastique avec un bouchon ou un duvet en acétate de cellulose et notez toutes les mouches perdues lors de ce transfert.
Marquez les flacons de famine contenant des mouches femelles avec une rayure. Pour éviter tout mélange accidentel, laissez les flacons avec des mouches postales non marqués. Préparez la chambre d’humidité pour une exposition nocturne en plaçant six serviettes en papier standard au fond.
Ensuite, faites tremper les serviettes en papier avec 100 millilitres d’eau et placez la grille en plastique sur les serviettes humides pour vous assurer que les flacons n’entrent pas en contact avec les serviettes en papier saturées. Après avoir placé les plateaux de flacons de famine en position horizontale dans la chambre d’humidité, transférez la chambre d’humidité dans un incubateur à 25 degrés Celsius pour une incubation nocturne. Pour préparer les flacons d’exposition chimique, transférer quatre flacons de mouches femelles affamées contenant 20 mouches par flacon à quatre flacons d’exposition de chaque concentration chimique.
Étiquetez ces flacons comme femelles. Préparer des flacons d’exposition chimique contenant du colorant bleu en transférant un flacon de mouches femelles affamées dans un flacon d’exposition bleu pour chaque concentration chimique. Étiquetez ce flacon comme femelle.
Notez le nombre de mouches présentes dans chaque flacon après le transfert et notez le nombre de mouches mortes ou échappées. Normalement, les 20 mouches devraient survivre à la famine et au transfert nocturnes. Placez les flacons d’exposition horizontalement dans une chambre d’humidité fraîchement préparée avant de placer la chambre dans un incubateur à 25 degrés Celsius avec environ 60% d’humidité et un cycle de lumière de 12 à 12 heures est à l’obscurité.
Examiner les flacons d’exposition 24 et 48 heures après le début de l’exposition chimique. Compter et noter les mouches mortes dans chaque flacon à chaque point temporel. Pour déterminer si les mouches exposées ont consommé le milieu d’exposition bleu dans les flacons d’exposition bleus après 24 heures d’exposition chimique, examinez les parois du flacon pour détecter la présence de matières fécales bleues qui apparaissent sous forme de petits points sur le côté du flacon d’exposition et du flacon.
Ensuite, anesthésiez les mouches à l’aide de dioxyde de carbone avant d’examiner l’abdomen pour détecter la présence de colorant bleu. Examiner les mouches pour détecter des comportements alimentaires anormaux tels que la régurgitation, la distension des cultures et la rupture de la fonction de barrière intestinale. Une fois cela fait, jetez tous les flacons, papiers filtres, bouchons et mouches contaminés dans les conteneurs de déchets chimiques appropriés.
S’il reste des mouches vivantes dans les flacons, congelez-les avant de les jeter dans le conteneur à déchets approprié. L’efficacité du protocole a été déterminée en exposant des organes adultes ou des mouches mâles et femelles à la plage de concentrations d’arsonite de sodium de zéro à deux millimolaires pour obtenir une létalité après 48 heures d’exposition. Dans des expériences ultérieures, des concentrations de zéro à cinq millimolaires ont été sélectionnées pour définir plus précisément la courbe dose-réponse à l’arsonite de sodium.
Selon ce modèle, la dose létale finale, ou DL 10, DL 25 et DL 50 des mouches mâles nourries avec de l’arsonite de sodium était respectivement de 0,30 millimolaire, 0,50 millimolaire et 0,65 millimolaire. Ces valeurs étaient légèrement plus élevées pour les mouches femelles avec une DL 10 de 0,30 millimolaire, une DL 25 de 0,65 millimolaire et une DL 50 de 0,90 millimolaire. Chez les mouches mâles et femelles nourries avec des solutions d’arsonite de sodium contenant 1% F D et C bleu, la nourriture ingérée a parfois été régurgitée à des doses supérieures à 0,2 millimolaire pour les femelles et 0,5 millimolaire pour les mâles, ce qui suggère que la régurgitation pourrait jouer un rôle clé dans la réponse des filia scories à l’empoisonnement à l’arsenic.
En suivant ce protocole d’exposition, les mouches peuvent être facilement collectées pour une analyse plus approfondie, y compris des études génomiques et métabolomiques. Ce protocole est la première étape dans l’établissement de la mouche des fruits drosophila melanogaster comme modèle génétique commun pour mener des études à grande échelle de toxicologie de précision.
