이 프로토콜은 초파리를 화학 안전성 테스트의 표준 모델로 확립하고 일반적으로 NAM이라고 하는 새로운 접근 방법론을 개발하기 위한 중요한 단계를 나타냅니다. 상기 프로토콜은 성체 초파리 멜라노가스터의 생존력에 대한 화학적 독성 물질 효과를 평가하기 위해 액체 매질을 이용하는 효율적이고 저렴한 방법을 기술한다. 먼저 1등급 셀룰로오스 크로마토그래피 용지 4장을 쌓고 2인치 너비의 스트립으로 자릅니다.
꽃 모양의 염료가 들어있는 1.5 인치 종이 펀치를 사용하여 꽃 모양의 여과지 삽입물을 펀칭합니다. 22 x 220mm 광택이 없는 목재 다웰을 사용하여 필터 용지 스택을 직경 28.5mm의 폴리프로필렌 바이알의 바닥으로 밀어 넣습니다. 스택이 바이알 바닥에 단단히 고정되어 있는지 확인하십시오.
준비된 바이알을 플라스틱 또는 판지 트레이에 보관하고 사용할 때까지 트레이를 큰 비닐 봉지에 넣으십시오. 파리가 들어있는 유리 바이알을 열고, 준비된 플라스틱 바이알의 입에 놓고, 플라스틱 바이알의 바닥을 벤치 상단에 두드려 분류 된 성 일치 파리를 기아 바이알로 옮깁니다. 셀룰로오스 아세테이트 플러그 또는 플루그로 플라스틱 바이알을 닫고 이 이송에서 손실된 파리를 기록합니다.
암컷 파리가 들어있는 굶주린 약병에 줄무늬를 표시하십시오. 우발적인 혼합을 방지하려면 우편물이 있는 바이알에 표시를 하지 않은 상태로 두십시오. 바닥에 6개의 표준 종이 타월을 놓아 밤새 노출되도록 습도 챔버를 준비합니다.
그런 다음 종이 타월을 100ml의 물에 담그고 젖은 타월 위에 플라스틱 그리드를 놓아 바이알이 포화된 종이 타월과 접촉하지 않도록 합니다. 기아 바이알의 트레이를 습도 챔버 내의 수평 위치에 놓은 후 습도 챔버를 섭씨 25도 인큐베이터로 옮겨 하룻밤 배양합니다. 화학 물질 노출 바이알을 준비하기 위해 바이알당 20마리의 파리가 들어 있는 굶주린 암컷 파리 바이알 4개를 각 화학 농도의 노출 바이알 4개로 옮깁니다.
이 바이알을 여성으로 표시하십시오. 굶주린 암컷 파리 바이알을 각 화학 농도에 대한 파란색 노출 바이알에 옮겨 파란색 염료가 들어 있는 화학 물질 노출 바이알을 준비합니다. 이 바이알을 암품으로 표시하십시오.
이송 후 각 바이알에 존재하는 파리의 수를 기록하고 죽거나 탈출한 파리의 수를 기록하십시오. 일반적으로 20 마리의 파리는 모두 하룻밤 사이에 굶주림과 이동에서 살아남아야합니다. 약 60% 습도의 섭씨 25도 인큐베이터에 챔버를 놓기 전에 새로 준비된 습도 챔버에 노출 바이알을 수평으로 놓고 12시간 동안 빛이 어두운 주기로 합니다.
화학 물질 노출 시작 후 24시간 및 48시간 후에 노출 바이알을 검사합니다. 각 시점에서 각 바이알에 죽은 파리를 세고 기록합니다. 노출된 파리가 화학 물질에 노출된 지 24시간 후에 파란색 노출 바이알의 파란색 노출 매체를 소비했는지 확인하려면 바이알 벽에 노출 바이알과 플루그 측면에 작은 점으로 나타나는 파란색 대변의 징후가 있는지 검사합니다.
다음으로, 복부에 파란색 염료가 있는지 검사하기 전에 이산화탄소를 사용하여 파리를 마취하십시오. 역류, 작물 팽창 및 장 장벽 기능의 파괴와 같은 비정상적인 섭식 행동에 대해 파리를 검사하십시오. 완료되면 오염된 모든 바이알, 여과지, 플러그 및 파리를 적절한 화학 폐기물 용기에 버리십시오.
살아있는 파리가 바이알에 남아 있으면 바이알을 얼리고 적절한 폐기물 용기에 버리십시오. 프로토콜 효능은 성인 기관 또는 수컷 및 암컷 파리를 0 내지 2 밀리몰의 나트륨 비소나이트 농도 범위에 노출시켜 노출 48시간 후 치사율을 점수화함으로써 결정하였다. 후속 실험에서, 나트륨 비소나이트 용량 반응 곡선을 보다 정확하게 정의하는 0 내지 5밀리몰 농도가 선택되었다.
이 모델에 기초하여, 나트륨 비소석을 먹인 수컷 파리의 최종 치사량 또는 LD10, LD25 및 LD50은 각각 0.30 밀리몰, 0.50 밀리몰 및 0.65 밀리몰이었다. 이 값은 0.30 밀리몰의 LD 10, 0.65 밀리몰의 LD 25 및 0.90 밀리몰의 LD 50을 갖는 암컷 파리에서 약간 더 높았다. 나트륨 비소석 용액을 함유한 1%F D 및 C 블루를 섭취한 수컷과 암컷 파리에서 섭취한 음식은 때때로 암컷의 경우 0.2밀리몰, 수컷의 경우 0.5밀리몰 이상의 용량으로 역류되어 역류가 비소 중독에 대한 드로스 필리아 반응에 핵심적인 역할을 할 수 있음을 시사합니다.
이 노출 프로토콜에 따라 파리는 게놈 및 대사체 연구를 포함한 추가 분석을 위해 쉽게 수집 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 초파리 초파리 멜라노가스터를 정밀 독성학의 대규모 연구를 수행하기 위한 일반적인 유전 모델로 확립하는 첫 번째 단계입니다.
