Протокол представляет собой важный шаг на пути к созданию дрозофилы в качестве стандартной модели для испытаний на химическую безопасность и для разработки новых методологий подхода, обычно называемых NAM. В протоколе описан эффективный и недорогой метод, использующий жидкие среды для оценки влияния химических токсикантов на жизнеспособность взрослой особи Drosophila melanogaster. Начните с того, что сложите четыре листа целлюлозной хроматографической бумаги первого сорта и разрежьте их на полоски шириной два дюйма.
Выдавите вставки из фильтровальной бумаги в форме цветка, используя 1.5-дюймовый бумажный перфоратор, содержащий краситель в форме цветка. Вставьте стопку фильтровальной бумаги на дно полипропиленового флакона диаметром 28,5 мм с помощью деревянного дюбеля без лака размером 22 на 220 миллиметров. Убедитесь, что стопка дает надежно расположенную на дне флакона.
Храните подготовленные флаконы в пластиковых или картонных лотках и поместите лотки в большие полиэтиленовые пакеты до использования. Откройте стеклянный флакон с мухами, поместите его на горловину подготовленного пластикового флакона и перенесите отсортированных мух, подобранных по полу, во флакон для голодания, постукивая дном пластикового флакона по столешнице. Закройте пластиковый флакон пробкой из ацетата целлюлозы или флугом и запишите всех мух, потерянных при этой передаче.
Пометьте полоской флаконы, содержащие самок мух. Во избежание случайного смешивания оставляйте флаконы с кольчужными мухами без опознавательных знаков. Подготовьте камеру влажности к ночному воздействию, положив на дно шесть стандартных бумажных полотенец.
Затем смочите бумажные полотенца 100 миллилитрами воды и поместите пластиковую сетку поверх влажных полотенец, чтобы флаконы не соприкасались с пропитанными бумажными полотенцами. После размещения лотков с голодными флаконами в горизонтальном положении в камере влажности перенесите камеру влажности в инкубатор с температурой 25 градусов Цельсия для ночной инкубации. Чтобы подготовить флаконы с химическим воздействием, перенесите четыре флакона голодающих самок мух, содержащих 20 мух на флакон, в четыре флакона с экспозицией каждой химической концентрации.
Пометьте эти флаконы как женские. Приготовьте флаконы с химическим воздействием, содержащие синий краситель, перелив флакон с голодными самками мух в синий флакон для воздействия на каждую химическую концентрацию. Пометьте этот флакон как женский.
Запишите количество мух, присутствующих в каждом флаконе после переноса, и отметьте количество погибших или сбежавших. В норме все 20 мух должны пережить ночное голодание и перелететь. Поместите экспонированные флаконы горизонтально в свежеприготовленную камеру влажности, прежде чем поместить камеру в инкубатор с температурой 25 градусов по Цельсию с влажностью примерно 60% и циклом от 12 до 12 часов от света до темноты.
Осмотрите экспозиционные флаконы через 24 и 48 часов после начала химического воздействия. Подсчитайте и запишите мертвых мух в каждом флаконе в каждый момент времени. Чтобы определить, потребляли ли подвергшиеся воздействию мухи синие экспонирующие среды в синих экспозиционных флаконах через 24 часа после химического воздействия, осмотрите стенки флакона на наличие признаков синих фекалий, которые появляются в виде маленьких точек на боковой стороне экспонирующего флакона и флуг.
Затем обезболите мух углекислым газом, прежде чем осматривать брюшко на наличие синего красителя. Исследуйте мух на предмет ненормального пищевого поведения, такого как срыгивание, растяжение урожая и нарушение барьерной функции кишечника. После этого выбросьте все загрязненные флаконы, фильтровальную бумагу, пробки и мухи в соответствующие контейнеры для химических отходов.
Если во флаконах остались живые мухи, заморозьте флаконы перед тем, как выбросить их в соответствующий контейнер для отходов. Эффективность протокола определяли путем воздействия на взрослый орган или самцов и самок мух в диапазоне концентраций арсонита натрия от нуля до двух миллимолей для оценки летальности после 48 часов воздействия. В последующих экспериментах были выбраны концентрации от нуля до пяти миллимолей, которые более точно определяли кривую реакции на дозу арсонита натрия.
Основываясь на этой модели, конечная смертельная доза, или LD 10, LD 25 и LD 50 самцов мух, которых кормили арсонитом натрия, составляла 0,30 миллимоля, 0,50 миллимоля и 0,65 миллимоля соответственно. Эти значения были немного выше для самок мух с LD 10 0,30 миллимоля, LD 25 0,65 миллимоляра и LD 50 0,90 миллимоля. У самцов и самок мух, которых кормили 1% F, D и C синим, содержащими растворы арсонита натрия, проглоченную пищу иногда отрыгивали в дозах выше 0,2 миллимоля для самок и 0,5 миллимоляра для самцов, что позволяет предположить, что регургитация может играть ключевую роль в реакции окалины на отравление мышьяком.
Следуя этому протоколу воздействия, мухи могут быть легко собраны для дальнейшего анализа, включая геномные и метаболомные исследования. Этот протокол является первым шагом в установлении плодовой мушки drosophila melanogaster в качестве общей генетической модели для проведения крупномасштабных исследований точной токсикологии.
