يوفر هذا البروتوكول إرشادات حول كيفية تجنب التلوث بالذيفان الداخلي أثناء عزل الحويصلات خارج الخلية من طافات زراعة الخلايا ، وكيفية تقييمها بشكل صحيح. الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هي أن كل مختبر معني بالمركبات الكهربائية قد يحد من تلوث السموم الداخلية عن طريق الحفاظ على إجراء معقم واستخدام معدات بسيطة ومتاحة على نطاق واسع. يجب على كل من يجرب هذه التقنية لأول مرة أن يبدأ بالوسائط الجديدة والكواشف والأواني البلاستيكية منخفضة السموم الداخلية وغير البيروجينية.
بالنسبة لهذا البروتوكول ، استخدم الكواشف الخالية من السموم الداخلية ، والماء ، ووسائط الاستزراع ، و PBS المصفى ، و FBS منخفض السموم الداخلية ، وأنابيب الطرد المركزي الفائقة. للبدء ، اجمع المادة الطافية من خطوط خلايا SW480 و SW620 المزروعة مسبقا في أنابيب سعة 15 ملليلتر تحمل علامات مناسبة. قم بإزالة بقايا الخلايا عن طريق الطرد المركزي للطاف عند 500 × جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.
دون إزعاج الحطام ، اجمع المادة الطافية في أنبوب جديد مسمى ، وجهاز طرد مركزي عند 3،200 × جم لمدة 12 دقيقة عند أربع درجات مئوية. انقل بعناية 45 مل من المادة الطافية إلى أنبوب معقم رأسيا سعة 50 ملليلتر ، دون ترطيب حواف الأنبوب. لف غطاء الأنبوب بغشاء معقم وشفاف ، وقم بتخزينه عموديا عند 80 درجة مئوية تحت الصفر للعزل اللاحق للحويصلات خارج الخلية.
ابدأ العزل عن طريق تحضير مرشحات حقنة 0.22 ميكرومتر ومحاقن وأنابيب تحتوي على حوالي 90 ملليلترا من المادة الطافية. املأ حقنة بالمادة الطافية ، وقم بتثبيت المرشح على محول الإبرة. قم بتصفية المادة الطافية من خلال المرشح في أنبوب سعة 50 ملليلتر.
ماصة سبعة ملليلتر من المرشح في أنبوب الطرد المركزي الفائق المعدة ، وأجهزة الطرد المركزي في 100،000 × غرام لمدة ساعتين عند أربع درجات مئوية. استخدم ماصة باستور معقمة للتخلص من المادة الطافية. اسحب الكريات إلى أنبوب طرد مركزي فائق باستخدام طرف ماصة طويل مصفى.
شطف الحويصلات خارج الخلية عن طريق إضافة سبعة ملليلتر من PBS المصفى الخالي من السموم الداخلية. بعد الطرد المركزي الفائق ، تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة باستور معقمة وأعد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني خال من السموم الداخلية. انقل التعليق إلى أنبوب اختبار معقم منخفض البروتين سعة 1.5 ملليلتر.
ثم انقل 10 ميكرولتر من التعليق إلى أنبوب جديد سعة 1.5 ملليلتر لمزيد من التحليل. لف غطاء الأنبوب واحفظه عند درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر. الآن ، في أنبوب جديد ، قم بتخفيف ميكرولتر واحد من التعليق باستخدام PBS المصفى بنسبة 1 إلى 1000 لتحليل تتبع الجسيمات النانوية.
لإجراء تحليل النشاف ، قم أولا بخلط 20 ميكروغرام من العينات مع مخزن مؤقت للتحميل. احتضان العينات عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ثم قم بتحميل 20 ميكروغرام من العينة في كل بئر من 10 إلى 14٪ من هلام بولي أكريلاميد مع SDS ، وقم بإجراء رحلان كهربائي لمدة 45 دقيقة عند 150 فولت ، مع تشغيل المخزن المؤقت.
بعد ذلك ، ضع الجل في آلة نقل مع مخزن مؤقت Towbin ، وقم بإجراء نقل شبه جاف للبروتينات على غشاء ثنائي فلوريد البولي فينيليدين عند 25 فولت لمدة ساعة واحدة. سد الغشاء مع 1٪ BSA عن طريق احتضانه لمدة ساعة واحدة على الروك. أضف الأجسام المضادة المخففة BSA ، المضادة ل CD9 أو anti-Alix ، إلى الغشاء ، واحتضانها طوال الليل عند أربع درجات مئوية على الروك.
بعد إزالة الأجسام المضادة ، اغسل الغشاء ثلاث مرات ب 10 ملليلتر من TBST لمدة 10 دقائق. أضف الآن أجساما مضادة ثانوية مضادة للأرانب أو مضادة للفأر ، واحتضانها مرة أخرى على الروك لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. تخلص من الجسم المضاد ، واغسل الغشاء كما هو موضح سابقا.
صب ملليلتر واحد من المحلول الذي يحتوي على الركيزة واللومينول بنسبة متساوية على الغشاء. ضع الغشاء على الفور في نظام التصوير ، وتصور أشرطة البروتين على الشاشة. في الدراسة الحالية ، أكد تحليل اللطخة الغربية وجود علامتين للحويصلة خارج الخلية ، CD9 و Alix.
كان متوسط حجم وتركيزات الحويصلات المعزولة من كل من SW480 و SW620 متشابهة. أظهر تحفيز الخلايا الوحيدة بجرعات مختلفة من عديد السكاريد الدهني ، أو LPS ، أن أقل جرعة من LPS تمكن من إفراز الإنترلوكين 10 وعامل نخر الورم في الخلايا الوحيدة كان 50 بيكوجرام لكل ملليلتر. أشار اختبار LAL الكروموجيني إلى أن تلوث LPS للحويصلات خارج الخلية كان حوالي 50 بيكوغرام لكل ملليلتر لكلا خطي الخلية.
أهم شيء يجب تذكره هو استخدام الكواشف الخالية من LPS أو المستنفدة ، وقياس LPS الروتيني في كل خطوة من خطوات الإجراء. منع تلوث السموم الداخلية أسهل من القضاء عليه. يحد البروتوكول المقترح من إمكانية حدوث نتائج خاطئة بسبب تلوث المركبات الكهربائية بالذيفان الداخلي ، ويسمح بتقييم نشاط المركبات الكهربائية لكل خلية.
البروتوكول المقترح مفيد للباحثين الذين يعملون مع الخلايا الحساسة للسموم الداخلية ، مثل الخلايا الوحيدة والخلايا المتغصنة والبلاعم.
