이 프로토콜은 세포 배양 상층액에서 세포외 소포체를 분리하는 동안 내독소 오염을 방지하는 방법과 이를 적절하게 평가하는 방법에 대한 지침을 제공합니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 EV와 관련된 모든 실험실이 무균 절차를 유지하고 간단하고 널리 사용 가능한 장비를 사용하여 내독소 오염을 제한할 수 있다는 것입니다. 이 기술을 처음 시도하는 모든 사람은 내독소가 적고 발열성이 없는 표지가 된 새로운 배지, 시약 및 플라스틱 제품으로 시작해야 합니다.
이 프로토콜의 경우 내독소가 없는 시약, 물, 배양 배지, 여과된 PBS, 초저내독소 FBS 및 초원심분리기 튜브를 사용합니다. 시작하려면 이전에 배양된 SW480 및 SW620 세포주에서 상층액을 적절하게 표지된 15밀리리터 튜브에 수집합니다. 상층액을 실온에서 5분 동안 500 x g로 원심분리하여 세포 파편을 제거합니다.
파편을 방해하지 않고 상층액을 새 라벨이 붙은 튜브에 모으고 섭씨 4도에서 12 분 동안 3, 200 x g에서 원심 분리합니다. 튜브의 가장자리를 적시지 않고 45 밀리리터의 상청액을 수직으로 배치 된 멸균 50 밀리리터 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 튜브의 캡을 멸균 투명 필름으로 감싸고 섭씨 영하 80도에서 수직으로 보관하여 세포외 소포를 분리합니다.
약 90ml의 상층액이 들어 있는 0.22마이크로미터 주사기 필터, 주사기 및 튜브를 준비하여 분리를 시작합니다. 주사기에 상청액을 채우고 필터를 바늘 어댑터에 고정하십시오. 필터를 통해 상청액을 50 밀리리터 튜브로 여과합니다.
여과액 7 밀리리터를 준비된 초원심분리 튜브에 피펫팅하고, 섭씨 4도에서 2시간 동안 100, 000 x g에서 원심분리한다. 멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여 상층액을 버리십시오. 긴 여과된 피펫 팁을 사용하여 펠릿을 초원심분리기 튜브로 당깁니다.
7밀리리터의 여과된 내독소가 없는 PBS를 추가하여 세포외 소포를 헹굽니다. 초원심분리 후, 멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여 상층액을 버리고 200마이크로리터의 내독소가 없는 PBS에 펠릿을 재현탁합니다. 현탁액을 멸균된 1.5밀리리터 저단백질 결합 시험관으로 옮깁니다.
그런 다음 추가 분석을 위해 10마이크로리터의 현탁액을 새로운 1.5밀리리터 튜브로 옮깁니다. 튜브의 캡을 감싸고 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 이제 새로운 튜브에 나노 입자 추적 분석을 위해 여과 된 PBS를 사용하여 1 : 1000의 비율로 1 마이크로 리터의 현탁액을 희석합니다.
블로팅 분석을 수행하려면 먼저 20마이크로그램의 샘플을 로딩 버퍼와 혼합합니다. 샘플을 섭씨 70도에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 20마이크로그램의 샘플을 SDS가 포함된 10-14% 폴리아크릴아미드 겔의 각 웰에 로드하고 완충액을 사용하여 150볼트에서 45분 동안 전기영동을 수행합니다.
다음으로, Towbin 완충액이 있는 이송 기계에 겔을 넣고 1시간 동안 25볼트에서 폴리비닐리덴 디플루오라이드 멤브레인 상에 단백질의 반건조 전사를 수행합니다. 멤브레인을 1%BSA로 차단하여 로커에서 1시간 동안 배양합니다. BSA 희석 항체인 항-CD9 또는 항-알릭스를 멤브레인에 넣고 로커에서 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다.
항체를 제거한 후, 10 분 동안 10 밀리리터의 TBST로 멤브레인을 3 회 세척한다. 이제 염소 항 토끼 또는 항 마우스 2 차 항체를 넣고 실온에서 1 시간 동안 로커에서 다시 배양하십시오. 항체를 버리고 이전에 시연된 대로 멤브레인을 세척합니다.
기질과 루미놀을 함유한 용액 1밀리리터를 멤브레인에 같은 비율로 붓습니다. 즉시 멤브레인을 이미징 시스템에 배치하고 화면에서 단백질 밴드를 시각화합니다. 본 연구에서 웨스턴 블롯 분석을 통해 두 개의 세포외 소포 마커인 CD9와 Alix의 존재가 확인되었습니다.
SW480과 SW620 모두에서 분리된 소포의 평균 크기와 농도는 비슷했습니다. 다른 용량의 지질다당류(LPS)로 단핵구를 자극한 결과 인터루킨 10의 분비를 가능하게 하는 LPS의 최저 용량과 단핵구의 종양 괴사 인자는 밀리리터당 50피코그램이었습니다. 발색 LAL 테스트는 세포외 소포의 LPS 오염이 두 세포주 모두에서 밀리리터당 약 50피코그램임을 나타냅니다.
기억해야 할 가장 중요한 것은 LPS가 없거나 고갈된 시약을 사용하고 절차의 각 단계에서 일상적인 LPS 측정입니다. 내독소 오염을 예방하는 것이 제거하는 것보다 쉽습니다. 제안된 프로토콜은 내독소에 의한 EV의 오염으로 인한 잘못된 결과의 가능성을 제한하고 세포당 EV 활성을 평가할 수 있도록 합니다.
제안된 프로토콜은 단핵구, 수지상 세포 및 대식세포와 같은 내독소에 민감한 세포를 다루는 연구자에게 유용합니다.
