Этот протокол содержит рекомендации о том, как избежать загрязнения эндотоксином во время выделения внеклеточных везикул из надосадочных продуктов клеточных культур и как правильно их оценивать. Основное преимущество этого протокола заключается в том, что каждая лаборатория, занимающаяся электромобилями, может ограничить загрязнение эндотоксинами, соблюдая асептическую процедуру и используя простое и широко доступное оборудование. Каждый, кто пробует эту технику впервые, должен начать с новых носителей, реагентов и пластиковой посуды с низким содержанием эндотоксинов, не имеющих пирогенной маркировки.
Для этого протокола используйте реагенты, не содержащие эндотоксинов, воду, питательные среды, фильтрованные PBS, FBS со сверхнизким содержанием эндотоксина и ультрацентрифужные пробирки. Для начала соберите надосадочную жидкость из ранее культивируемых клеточных линий SW480 и SW620 в соответствующим образом помеченные 15-миллилитровые пробирки. Удалите клеточный мусор центрифугированием надосадочной жидкости при 500 x g в течение пяти минут при комнатной температуре.
Не беспокоя мусор, соберите надосадочную жидкость в новую маркированную пробирку и центрифугу при 3 200 x g в течение 12 минут при четырех градусах Цельсия. Осторожно перелейте 45 миллилитров надосадочной жидкости в вертикально расположенную стерильную 50-миллилитровую пробирку, не смачивая края пробирки. Оберните крышку пробирки стерильной прозрачной пленкой и храните ее вертикально при температуре минус 80 градусов Цельсия для последующей изоляции внеклеточных везикул.
Начните изоляцию с подготовки шприцевых фильтров, шприцев и пробирок размером 0,22 микрометра, содержащих примерно 90 миллилитров надосадочной жидкости. Наполните шприц надосадочной жидкостью и закрепите фильтр на адаптере иглы. Отфильтруйте надосадочную жидкость через фильтр в 50-миллилитровую трубку.
Пипеткой налейте семь миллилитров фильтрата в подготовленную ультрацентрифужную пробирку и центрифугу при 100 000 х г в течение двух часов при четырех градусах Цельсия. Используйте стерильную пипетку Пастера, чтобы избавиться от надосадочной жидкости. Вытащите гранулы в ультрацентрифужную трубку с помощью длинного фильтрованного наконечника пипетки.
Промойте внеклеточные везикулы, добавив семь миллилитров отфильтрованного PBS, не содержащего эндотоксинов. После ультрацентрифугирования выбросьте надосадочную жидкость с помощью стерильной пипетки Пастера и ресуспендируйте гранулу в 200 микролитрах PBS, не содержащего эндотоксинов. Перенесите суспензию в стерильную 1,5-миллилитровую пробирку с низким содержанием белка.
Затем перелейте 10 микролитров суспензии в новую 1,5-миллилитровую пробирку для дальнейшего анализа. Оберните крышку тюбика и храните ее при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Теперь в новую пробирку разбавьте один микролитр суспензии, используя отфильтрованный PBS в соотношении 1 к 1000 для анализа отслеживания наночастиц.
Чтобы выполнить анализ блоттинга, сначала смешайте 20 мкг образцов с загрузочным буфером. Инкубируйте образцы при температуре 70 градусов Цельсия в течение 10 минут. Затем загрузите 20 мкг образца в каждую лунку 10-14% полиакриламидного геля с SDS и проведите электрофорез в течение 45 минут при напряжении 150 вольт с работающим буфером.
Затем поместите гель в машину для переноса с буфером Towbin и выполните полусухой перенос белков на мембрану из поливинилидендифторида при напряжении 25 вольт в течение одного часа. Заблокируйте мембрану 1% BSA, инкубировав ее в течение одного часа на коромысле. Добавьте разбавленные BSA антитела, анти-CD9 или анти-Alix, к мембране и инкубируйте в течение ночи при четырех градусах Цельсия на коромысле.
После удаления антител трижды промойте мембрану 10 миллилитрами TBST в течение 10 минут. Теперь добавьте вторичное антитело против кролика или мыши и снова инкубируйте на коромысле в течение одного часа при комнатной температуре. Выбросьте антитело и промойте мембрану, как показано ранее.
Налейте на мембрану один миллилитр раствора, содержащего субстрат и люминол в равном соотношении. Немедленно поместите мембрану в систему визуализации и визуализируйте белковые полосы на экране. В настоящем исследовании анализ вестерн-блоттинга подтвердил наличие двух внеклеточных маркеров везикул, CD9 и Alix.
Средний размер и концентрации везикул, выделенных как из SW480, так и из SW620, были одинаковыми. Стимуляция моноцитов различными дозами липополисахарида, или ЛПС, показала, что самая низкая доза ЛПС, обеспечивающая секрецию интерлейкина 10, а фактор некроза опухоли в моноцитах составлял 50 пикограмм на миллилитр. Хромогенный тест LAL показал, что загрязнение ЛПС внеклеточных везикул составляло около 50 пикограмм на миллилитр для обеих клеточных линий.
Самое важное, что нужно помнить, - это использование реагентов, не содержащих ЛПС или обедненных реагентов, а также регулярное измерение ЛПС на каждом этапе процедуры. Предотвратить загрязнение эндотоксинами легче, чем устранить его. Предложенный протокол ограничивает возможность ложных результатов из-за контаминации ЭВ эндотоксином и позволяет оценить активность ВВ на клетку.
Предлагаемый протокол полезен для исследователей, работающих с чувствительными к эндотоксину клетками, такими как моноциты, дендритные клетки и макрофаги.
