Este protocolo fornece orientações sobre como evitar a contaminação com endotoxina durante o isolamento de vesículas extracelulares de sobrenadantes de cultura celular e como avaliá-las adequadamente. A principal vantagem deste protocolo é que todo laboratório preocupado com EVs pode limitar a contaminação por endotoxinas mantendo um procedimento asséptico e usando equipamentos simples e amplamente disponíveis. Todo mundo que está tentando esta técnica pela primeira vez deve começar com novos meios, reagentes e plasticware que são de baixa endotoxina, não pirogênicos rotulados.
Para este protocolo, utilizar reagentes livres de endotoxinas, água, meios de cultura, PBS filtrado, SFB ultra baixa endotoxina e tubos de ultracentrífuga. Para começar, colete o sobrenadante de linhagens celulares SW480 e SW620 previamente cultivadas em tubos de 15 mililitros devidamente marcados. Remova os restos celulares centrifugando o sobrenadante a 500 x g durante cinco minutos à temperatura ambiente.
Sem perturbar os detritos, colete o sobrenadante em um novo tubo marcado e centrifugue a 3.200 x g por 12 minutos a quatro graus Celsius. Transfira cuidadosamente 45 mililitros do sobrenadante para um tubo estéril de 50 mililitros colocado verticalmente, sem molhar as bordas do tubo. Embrulhe a tampa do tubo com um filme estéril e transparente e armazene-o verticalmente a 80 graus Celsius negativos para posterior isolamento das vesículas extracelulares.
Comece o isolamento preparando filtros de seringas, seringas e tubos de 0,22 micrômetros contendo aproximadamente 90 mililitros de sobrenadante. Encha uma seringa com o sobrenadante e fixe o filtro no adaptador da agulha. Filtre o sobrenadante através do filtro em um tubo de 50 mililitros.
Pipetar sete mililitros do filtrado para um tubo de ultracentrífuga preparado e centrifugar a 100.000 x g por duas horas a quatro graus Celsius. Use uma pipeta Pasteur estéril para descartar o sobrenadante. Puxe os pellets para dentro de um tubo de ultracentrífuga usando uma ponta de pipeta longa filtrada.
Enxaguar as vesículas extracelulares adicionando sete mililitros de PBS livre de endotoxina filtrada. Após a ultracentrifugação, descartar o sobrenadante com pipeta Pasteur estéril e ressuspender o pellet em 200 microlitros de PBS livre de endotoxina. Transfira a suspensão para um tubo de ensaio estéril de 1,5 mililitro de baixa ligação a proteínas.
Em seguida, transfira 10 microlitros de suspensão para um novo tubo de 1,5 mililitro para análise posterior. Embrulhe a tampa do tubo e guarde-a a 80 graus Celsius negativos. Agora, em um novo tubo, dilua um microlitro de suspensão usando PBS filtrado na proporção de 1 para 1000 para análise de rastreamento de nanopartículas.
Para realizar a análise de blotting, primeiro misture 20 microgramas das amostras com um tampão de carga. Incubar as amostras a 70 graus Celsius durante 10 minutos. Em seguida, carregar 20 microgramas da amostra em cada poço de um gel de poliacrilamida de 10 a 14% com SDS e realizar eletroforese por 45 minutos a 150 volts, com tampão de funcionamento.
Em seguida, coloque o gel em uma máquina de transferência com tampão Towbin e realize uma transferência semi-seca de proteínas para uma membrana de difluoreto de polivinilideno a 25 volts por uma hora. Bloqueie a membrana com 1% de BSA incubando-a por uma hora em um balancim. Adicione anticorpos diluídos BSA, anti-CD9 ou anti-Alix, à membrana e incube durante a noite a quatro graus Celsius em um balancim.
Após a remoção dos anticorpos, lave a membrana três vezes com 10 mililitros de TBST por 10 minutos. Agora adicione o anticorpo secundário de cabra anti-coelho ou anti-camundongo e incube novamente em um balancim por uma hora à temperatura ambiente. Descarte o anticorpo e lave a membrana conforme demonstrado anteriormente.
Deite um mililitro da solução contendo substrato e luminol numa proporção igual sobre a membrana. Coloque imediatamente a membrana em um sistema de imagem e visualize as bandas de proteína na tela. No presente estudo, a análise por western blot confirmou a presença de dois marcadores de vesícula extracelular, CD9 e Alix.
O tamanho médio e as concentrações das vesículas isoladas de SW480 e SW620 foram semelhantes. A estimulação de monócitos com diferentes doses de lipopolissacarídeo, ou LPS, mostrou que a menor dose de LPS permitiu a secreção de interleucina 10 e o fator de necrose tumoral em monócitos foi de 50 picogramas por mililitro. O teste de LAL cromogênico indicou que a contaminação por LPS das vesículas extracelulares foi de cerca de 50 picogramas por mililitro para ambas as linhagens celulares.
A coisa mais importante a lembrar é o uso de reagentes livres ou esgotados de LPS e a medição rotineira de LPS em cada etapa do procedimento. Prevenir a contaminação por endotoxinas é mais fácil do que eliminá-la. O protocolo proposto limita a possibilidade de falsos resultados devido à contaminação dos EVs com endotoxina e permite avaliar a atividade dos EVs por célula.
O protocolo proposto é útil para pesquisadores que trabalham com células sensíveis a endotoxinas, como monócitos, células dendríticas e macrófagos.
