Ce protocole fournit des lignes directrices sur la façon d’éviter la contamination par l’endotoxine lors de l’isolement des vésicules extracellulaires à partir de surnageants de culture cellulaire, et comment les évaluer correctement. Le principal avantage de ce protocole est que chaque laboratoire concerné par les VE peut limiter la contamination par les endotoxines en conservant une procédure aseptique et en utilisant un équipement simple et largement disponible. Tous ceux qui essaient cette technique pour la première fois devraient commencer par de nouveaux médias, réactifs et articles en plastique marqués à faible teneur en endotoxines et non pyrogènes.
Pour ce protocole, utilisez des réactifs exempts d’endotoxines, de l’eau, des milieux de culture, du PBS filtré, du FBS à très faible teneur en endotoxines et des tubes à ultracentrifugation. Pour commencer, collectez le surnageant des lignées cellulaires SW480 et SW620 précédemment cultivées dans des tubes de 15 millilitres correctement étiquetés. Enlevez les débris cellulaires en centrifugeant le surnageant à 500 x g pendant cinq minutes à température ambiante.
Sans déranger les débris, recueillir le surnageant dans un nouveau tube étiqueté et centrifuger à 3, 200 x g pendant 12 minutes à quatre degrés Celsius. Transférez soigneusement 45 millilitres du surnageant dans un tube stérile de 50 millilitres placé verticalement, sans mouiller les bords du tube. Enveloppez le capuchon du tube avec un film stérile et transparent et stockez-le verticalement à moins 80 degrés Celsius pour l’isolement ultérieur des vésicules extracellulaires.
Commencez l’isolement en préparant des filtres à seringues, des seringues et des tubes contenant environ 90 millilitres de surnageant. Remplissez une seringue avec le surnageant et fixez le filtre à l’adaptateur d’aiguille. Filtrer le surnageant à travers le filtre dans un tube de 50 millilitres.
Pipeter sept millilitres du filtrat dans un tube à ultracentrifugation préparé et centrifuger à 100 000 x g pendant deux heures à quatre degrés Celsius. Utilisez une pipette Pasteur stérile pour jeter le surnageant. Tirez les granulés dans un tube à ultracentrifugation à l’aide d’une longue pointe de pipette filtrée.
Rincez les vésicules extracellulaires en ajoutant sept millilitres de PBS filtré sans endotoxines. Après ultracentrifugation, jeter le surnageant à l’aide d’une pipette Pasteur stérile et remettre la pastille en suspension dans 200 microlitres de PBS sans endotoxines. Transférer la suspension dans un tube à essai stérile de 1,5 millilitre à faible teneur en protéines.
Transférez ensuite 10 microlitres de suspension dans un nouveau tube de 1,5 millilitre pour une analyse plus approfondie. Enveloppez le capuchon du tube et rangez-le à moins 80 degrés Celsius. Maintenant, dans un nouveau tube, diluez un microlitre de suspension en utilisant du PBS filtré dans un rapport de 1 à 1000 pour l’analyse de suivi des nanoparticules.
Pour effectuer l’analyse par buvard, mélangez d’abord 20 microgrammes des échantillons avec un tampon de chargement. Incuber les échantillons à 70 degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, chargez 20 microgrammes de l’échantillon dans chaque puits d’un gel de polyacrylamide à 10 à 14% avec SDS, et effectuez une électrophorèse pendant 45 minutes à 150 volts, avec un tampon courant.
Ensuite, placez le gel dans une machine de transfert avec tampon Towbin et effectuez un transfert semi-sec de protéines sur une membrane de difluorure de polyvinylidène à 25 volts pendant une heure. Bloquez la membrane avec 1% de BSA en l’incubant pendant une heure sur une bascule. Ajouter des anticorps dilués BSA, anti-CD9 ou anti-Alix, à la membrane, et incuber pendant une nuit à quatre degrés Celsius sur une bascule.
Après avoir retiré les anticorps, laver la membrane trois fois avec 10 millilitres de TBST pendant 10 minutes. Maintenant, ajoutez l’anticorps secondaire anti-lapin ou anti-souris de chèvre, et incuber à nouveau sur une bascule pendant une heure à température ambiante. Jetez l’anticorps et lavez la membrane comme démontré précédemment.
Versez un millilitre de la solution contenant le substrat et le luminol à un rapport égal sur la membrane. Placez immédiatement la membrane dans un système d’imagerie et visualisez les bandes de protéines sur l’écran. Dans la présente étude, l’analyse par transfert Western a confirmé la présence de deux marqueurs de vésicules extracellulaires, CD9 et Alix.
La taille moyenne et les concentrations des vésicules isolées à partir de SW480 et SW620 étaient similaires. La stimulation des monocytes avec différentes doses de lipopolysaccharide, ou LPS, a montré que la dose la plus faible de LPS permettant la sécrétion d’interleukine 10 et le facteur de nécrose tumorale dans les monocytes était de 50 picogrammes par millilitre. Le test LAL chromogène a indiqué que la contamination LPS des vésicules extracellulaires était d’environ 50 picogrammes par millilitre pour les deux lignées cellulaires.
La chose la plus importante à retenir est l’utilisation de réactifs sans LPS ou épuisés, et la mesure de routine LPS à chaque étape de la procédure. Il est plus facile de prévenir la contamination par les endotoxines que de l’éliminer. Le protocole proposé limite la possibilité de faux résultats en raison de la contamination des VE par l’endotoxine et permet d’évaluer l’activité des VE par cellule.
Le protocole proposé est utile pour les chercheurs travaillant avec des cellules sensibles aux endotoxines, comme les monocytes, les cellules dendritiques et les macrophages.
