このプロトコルは、細胞培養上清から細胞外小胞を単離する際にエンドトキシンによる汚染を回避する方法と、それらを適切に評価する方法に関するガイドラインを提供します。このプロトコルの主な利点は、EVに関係するすべてのラボが、無菌手順を維持し、シンプルで広く利用可能な機器を使用することにより、エンドトキシン汚染を制限できることです。この技術を初めて試す人は誰でも、低エンドトキシンで非発熱性ラベルの付いた新しい培地、試薬、プラスチック製品から始める必要があります。
このプロトコルでは、エンドトキシンフリー試薬、水、培地、ろ過PBS、超低エンドトキシンFBS、および超遠心チューブを使用します。まず、以前に培養したSW480およびSW620細胞株の上清を、適切に標識された15ミリリットルのチューブに集めます。上清を500 x gで室温で5分間遠心分離することにより、細胞破片を除去します。
破片を乱すことなく、上清を新しいラベル付きチューブに集め、摂氏4度で12分間3, 200 x gで遠心分離します。チューブの端を濡らさずに、45ミリリットルの上清を垂直に配置された滅菌50ミリリットルのチューブに慎重に移します。チューブのキャップを滅菌済みの透明なフィルムで包み、摂氏マイナス80度で垂直に保管して、細胞外小胞を分離します。
約90ミリリットルの上清を含む0.22マイクロメートルのシリンジフィルター、シリンジ、およびチューブを準備することから分離を開始します。シリンジに上清を入れ、フィルターをニードルアダプターに固定します。上清をフィルターを通して50ミリリットルのチューブにろ過します。
7ミリリットルのろ液を調製した超遠心チューブにピペットで入れ、摂氏4度で2時間100, 000 x gで遠心分離します。滅菌パスツールピペットを使用して上清を廃棄します。長いろ過ピペットチップを使用して、ペレットを超遠心チューブに引き込みます。
7ミリリットルのろ過されたエンドトキシンフリーPBSを加えて、細胞外小胞を洗い流します。超遠心後、滅菌パスツールピペットを使用して上清を廃棄し、ペレットを200マイクロリットルのエンドトキシンフリーPBSに再懸濁します。懸濁液を滅菌済みの1.5ミリリットルの低タンパク質結合試験管に移します。
次に、10マイクロリットルの懸濁液を新しい1.5ミリリットルのチューブに移してさらに分析します。チューブのキャップを包み、マイナス80°Cで保管してください。次に、新しいチューブに入れ、ろ過されたPBSを使用して1マイクロリットルの懸濁液を1〜1000の比率で希釈し、ナノ粒子追跡分析を行います。
ブロッティング分析を行うには、まず20マイクログラムのサンプルをローディングバッファーと混合します。サンプルを摂氏70度で10分間インキュベートします。次に、SDSを含む10〜14%ポリアクリルアミドゲルの各ウェルに20マイクログラムのサンプルをロードし、ランニングバッファーを使用して150ボルトで45分間電気泳動を実行します。
次に、ゲルをトウビン緩衝液を含む転写機に入れ、ポリビニリデンジフルオリド膜上にタンパク質を25ボルトで1時間セミドライ転写する。メンブレンをロッカーで1時間インキュベートすることにより、1%BSAでブロックします。BSA希釈抗体、抗CD9または抗Alixをメンブレンに加え、ロッカー上で摂氏4度で一晩インキュベートします。
抗体を除去した後、膜を10ミリリットルのTBSTで10分間3回洗浄する。次に、ヤギ抗ウサギまたは抗マウス二次抗体を加え、ロッカー上で室温で1時間インキュベートします。抗体を廃棄し、前述のようにメンブレンを洗浄します。
基質とルミノールを含む1ミリリットルの溶液を同じ比率で膜に注ぎます。すぐにメンブレンをイメージングシステムに入れ、タンパク質バンドをスクリーン上で可視化します。本研究では、ウェスタンブロット分析により、CD9とAlixの2つの細胞外小胞マーカーの存在が確認されました。
SW480とSW620の両方から単離された小胞の平均サイズと濃度は類似していた。異なる用量のリポ多糖(LPS)による単球の刺激は、単球におけるインターロイキン10および腫瘍壊死因子の分泌を可能にするLPSの最低用量を示し、ミリリットルあたり50ピコグラムであった。発色LAL試験では、細胞外小胞のLPS汚染は、両方の細胞株でミリリットルあたり約50ピコグラムであることが示されました。
覚えておくべき最も重要なことは、LPSフリーまたは枯渇した試薬の使用、および手順の各ステップでの定期的なLPS測定です。エンドトキシン汚染を防ぐことは、それを排除するよりも簡単です。提案されたプロトコルは、エンドトキシンによるEVの汚染による誤った結果の可能性を制限し、細胞あたりのEV活性を評価することを可能にします。
提案されたプロトコルは、単球、樹状細胞、マクロファージなどのエンドトキシン感受性細胞を扱う研究者にとって有用です。
