Bu protokol, hücre dışı veziküllerin hücre kültürü süpernatantlarından izolasyonu sırasında endotoksin ile kontaminasyonun nasıl önleneceği ve bunların nasıl uygun şekilde değerlendirileceği konusunda kılavuzlar sağlar. Bu protokolün temel avantajı, EV'lerle ilgilenen her laboratuvarın aseptik bir prosedür uygulayarak ve basit ve yaygın olarak bulunan ekipman kullanarak endotoksin kontaminasyonunu sınırlayabilmesidir. Bu tekniği ilk kez deneyen herkes, düşük endotoksinli, pirojenik olmayan etiketli yeni medya, reaktifler ve plastik eşyalarla başlamalıdır.
Bu protokol için endotoksin içermeyen reaktifler, su, kültür ortamı, filtrelenmiş PBS, ultra düşük endotoksin FBS ve ultra santrifüj tüpleri kullanın. Başlamak için, süpernatantı daha önce kültürlenmiş SW480 ve SW620 hücre hatlarından uygun şekilde etiketlenmiş 15 mililitrelik tüplere toplayın. Süpernatantı oda sıcaklığında beş dakika boyunca 500 x g'de santrifüj ederek hücre kalıntılarını temizleyin.
Enkazı rahatsız etmeden, süpernatantı yeni bir etiketli tüpe toplayın ve dört santigrat derecede 12 dakika boyunca 3.200 x g'de santrifüjleyin. Süpernatantın 45 mililitresini, tüpün kenarlarını ıslatmadan dikey olarak yerleştirilmiş steril 50 mililitrelik bir tüpe dikkatlice aktarın. Tüpün kapağını steril, şeffaf bir filmle sarın ve hücre dışı veziküllerin daha sonra izolasyonu için eksi 80 santigrat derecede dikey olarak saklayın.
İzolasyona, yaklaşık 90 mililitre süpernatan içeren 0,22 mikrometre şırınga filtreleri, şırıngalar ve tüpler hazırlayarak başlayın. Bir şırıngayı süpernatantla doldurun ve filtreyi iğne adaptörüne sabitleyin. Süpernatantı filtreden 50 mililitrelik bir tüpe filtreleyin.
Filtratın yedi mililitresini hazırlanmış bir ultra santrifüj tüpüne pipet edin ve dört santigrat derecede iki saat boyunca 100.000 x g'de santrifüj. Supernatanı atmak için steril bir Pasteur pipeti kullanın. Peletleri uzun filtrelenmiş bir pipet ucu kullanarak ultra santrifüj tüpüne çekin.
Yedi mililitre filtrelenmiş endotoksin içermeyen PBS ekleyerek hücre dışı vezikülleri durulayın. Ultra santrifüjlemeden sonra, steril bir Pasteur pipeti kullanarak süpernatantı atın ve peleti 200 mikrolitre endotoksin içermeyen PBS'de yeniden askıya alın. Süspansiyonu steril bir 1.5 mililitre düşük protein bağlayıcı test tüpüne aktarın.
Daha sonra daha fazla analiz için 10 mikrolitre süspansiyonu yeni bir 1,5 mililitrelik tüpe aktarın. Tüpün kapağını sarın ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. Şimdi, yeni bir tüpe dönüştürün, nanopartikül izleme analizi için filtrelenmiş PBS kullanarak bir mikrolitre süspansiyonu 1 ila 1000 oranında seyreltin.
Lekeleme analizi yapmak için, önce numunelerin 20 mikrogramını bir yükleme tamponu ile karıştırın. Numuneleri 10 dakika boyunca 70 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra numunenin 20 mikrogramını SDS ile% 10 ila% 14'lük bir poliakrilamid jelin her bir kuyucuğuna yükleyin ve çalışan tamponla 150 voltta 45 dakika boyunca elektroforez yapın.
Daha sonra, jeli Towbin tamponlu bir transfer makinesine yerleştirin ve proteinlerin bir saat boyunca 25 voltta bir poliviniliden diflorür membranına yarı kuru bir transferini gerçekleştirin. Membranı bir rocker üzerinde bir saat boyunca inkübe ederek% 1 BSA ile bloke edin. Membrana BSA seyreltilmiş antikorlar, anti-CD9 veya anti-Alix ekleyin ve bir rocker üzerinde gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.
Antikorları çıkardıktan sonra, zarı 10 dakika boyunca 10 mililitre TBST ile üç kez yıkayın. Şimdi keçi anti-tavşan veya anti-fare ikincil antikoru ekleyin ve oda sıcaklığında bir saat boyunca bir rocker üzerinde tekrar inkübe edin. Antikoru atın ve membranı daha önce gösterildiği gibi yıkayın.
Substrat ve luminol içeren çözeltinin bir mililitresini membran üzerine eşit oranda dökün. Membranı hemen bir görüntüleme sistemine yerleştirin ve protein bantlarını ekranda görselleştirin. Bu çalışmada, western blot analizi, CD9 ve Alix olmak üzere iki hücre dışı vezikül belirtecinin varlığını doğruladı.
Hem SW480 hem de SW620'den izole edilen veziküllerin ortalama büyüklüğü ve konsantrasyonları benzerdi. Monositin farklı dozlarda lipopolisakkarit veya LPS ile uyarılması, interlökin 10'un salgılanmasını sağlayan en düşük LPS dozunu ve monositlerde tümör nekroz faktörünün mililitre başına 50 pikogram olduğunu göstermiştir. Kromojenik LAL testi, hücre dışı veziküllerin LPS kontaminasyonunun her iki hücre hattı için mililitre başına yaklaşık 50 pikogram olduğunu göstermiştir.
Hatırlanması gereken en önemli şey, LPS içermeyen veya tükenmiş reaktiflerin kullanılması ve prosedürün her adımında rutin LPS ölçümüdür. Endotoksin kontaminasyonunu önlemek, onu ortadan kaldırmaktan daha kolaydır. Önerilen protokol, EV'lerin endotoksin ile kontaminasyonu nedeniyle yanlış sonuç olasılığını sınırlar ve hücre başına EV'lerin aktivitesinin değerlendirilmesine izin verir.
Önerilen protokol, monositler, dendritik hücreler ve makrofajlar gibi endotoksine duyarlı hücrelerle çalışan araştırmacılar için yararlıdır.
