Este protocolo proporciona pautas sobre cómo evitar la contaminación con endotoxinas durante el aislamiento de vesículas extracelulares de sobrenadantes de cultivos celulares y cómo evaluarlas adecuadamente. La principal ventaja de este protocolo es que todos los laboratorios que se ocupan de los vehículos eléctricos pueden limitar la contaminación por endotoxinas manteniendo un procedimiento aséptico y utilizando equipos simples y ampliamente disponibles. Todos los que están probando esta técnica por primera vez deben comenzar con nuevos medios, reactivos y artículos de plástico que son de baja endotoxina, no etiquetados pirogénicos.
Para este protocolo, use reactivos libres de endotoxinas, agua, medios de cultivo, PBS filtrado, FBS de endotoxinas ultra bajas y tubos de ultracentrífuga. Para comenzar, recoja el sobrenadante de líneas celulares SW480 y SW620 previamente cultivadas en tubos de 15 mililitros debidamente etiquetados. Eliminar los restos celulares centrifugando el sobrenadante a 500 x g durante cinco minutos a temperatura ambiente.
Sin perturbar los desechos, recoja el sobrenadante en un nuevo tubo etiquetado y centrifugar a 3, 200 x g durante 12 minutos a cuatro grados centígrados. Transfiera cuidadosamente 45 mililitros del sobrenadante a un tubo estéril de 50 mililitros colocado verticalmente, sin humedecer los bordes del tubo. Envuelva la tapa del tubo con una película estéril y transparente, y guárdela verticalmente a menos 80 grados centígrados para el posterior aislamiento de vesículas extracelulares.
Comience el aislamiento preparando filtros de jeringa de 0,22 micrómetros, jeringas y tubos que contengan aproximadamente 90 mililitros de sobrenadante. Llene una jeringa con el sobrenadante y fije el filtro al adaptador de aguja. Filtre el sobrenadante a través del filtro en un tubo de 50 mililitros.
Pipetear siete mililitros del filtrado en un tubo de ultracentrífuga preparado y centrifugar a 100, 000 x g durante dos horas a cuatro grados centígrados. Utilice una pipeta estéril de Pasteur para desechar el sobrenadante. Tire de los gránulos en un tubo de ultracentrífuga con una punta de pipeta filtrada larga.
Enjuague las vesículas extracelulares agregando siete mililitros de PBS filtrado libre de endotoxinas. Después de la ultracentrifugación, deseche el sobrenadante con una pipeta estéril de Pasteur y vuelva a suspender el pellet en 200 microlitros de PBS libre de endotoxinas. Transfiera la suspensión a un tubo de ensayo estéril de 1,5 mililitros de baja unión a proteínas.
Luego transfiera 10 microlitros de suspensión a un nuevo tubo de 1.5 mililitros para su posterior análisis. Envuelva la tapa del tubo y guárdelo a menos 80 grados centígrados. Ahora, en un nuevo tubo, diluya un microlitro de suspensión utilizando PBS filtrado en una proporción de 1 a 1000 para el análisis de seguimiento de nanopartículas.
Para realizar el análisis de transferencia, primero mezcle 20 microgramos de las muestras con un tampón de carga. Incubar las muestras a 70 grados centígrados durante 10 minutos. Luego cargue 20 microgramos de la muestra en cada pocillo de un gel de poliacrilamida al 10 a 14% con SDS, y realice la electroforesis durante 45 minutos a 150 voltios, con tampón de funcionamiento.
A continuación, coloque el gel en una máquina de transferencia con tampón Towbin y realice una transferencia semiseca de proteínas a una membrana de difluoruro de polivinilideno a 25 voltios durante una hora. Bloquee la membrana con 1% BSA incubándola durante una hora en un balancín. Agregue anticuerpos diluidos BSA, anti-CD9 o anti-Alix, a la membrana e incube durante la noche a cuatro grados centígrados en un balancín.
Después de eliminar los anticuerpos, lave la membrana tres veces con 10 mililitros de TBST durante 10 minutos. Ahora agregue anticuerpo secundario anti-conejo de cabra o anti-ratón, e incube nuevamente en un balancín durante una hora a temperatura ambiente. Deseche el anticuerpo y lave la membrana como se demostró anteriormente.
Vierta un mililitro de la solución que contiene sustrato y luminol en una proporción igual en la membrana. Coloque inmediatamente la membrana en un sistema de imágenes y visualice las bandas de proteínas en la pantalla. En el presente estudio, el análisis de Western blot confirmó la presencia de dos marcadores de vesículas extracelulares, CD9 y Alix.
El tamaño medio y las concentraciones de las vesículas aisladas tanto de SW480 como de SW620 fueron similares. La estimulación de monocitos con diferentes dosis de lipopolisacáridos, o LPS, mostró la dosis más baja de LPS que permite la secreción de interleucina 10 y el factor de necrosis tumoral en monocitos fue de 50 picogramos por mililitro. La prueba cromogénica de LAL indicó que la contaminación por LPS de las vesículas extracelulares fue de alrededor de 50 picogramos por mililitro para ambas líneas celulares.
Lo más importante que debe recordar es el uso de reactivos sin LPS o agotados, y la medición rutinaria de LPS en cada paso del procedimiento. Prevenir la contaminación por endotoxinas es más fácil que eliminarla. El protocolo propuesto limita la posibilidad de resultados falsos debido a la contaminación de EVs con endotoxina, y permite evaluar la actividad de EVs por célula.
El protocolo propuesto es útil para los investigadores que trabajan con células sensibles a las endotoxinas, como monocitos, células dendríticas y macrófagos.
