BS3'ü çapraz bağlayıcı olarak kullanan kimyasal çapraz bağlama testi, nörotransmitter reseptör hücre yüzey seviyesinin belirlenmesinde yardımcı olacaktır, bu da nöro iletimin etkinliğinin kritik bir belirleyicisidir. Bu tahlil, hayvan modellerinde çeşitli psikotropik ajanlara veya psikojenik stres modalitelerine yanıt olarak reseptör dinamiklerinin beyin bölgesine özgü değerlendirilmesi için özellikle yararlıdır. Başlamak için, beyni ötenazi C57BL / 6J farenin kafatasından hızla çıkarın.
Buz gibi soğuk PBS içeren bir Petri kabına 10 ila 15 saniye batırın. Soğutulmuş beyni, ventral tarafa bakan buz üzerindeki beyin matrisine yerleştirin. Beyni koronal olarak kesmek için, ilk tıraş bıçağını koku alma ampulü ile koku alma pedinkülü arasındaki sınırdan yerleştirin.
Üç ila dört ek tıraş bıçağı kullanarak, beynin ön kısmını bir milimetre aralıklarla koronal olarak seri olarak kesin. Koronal dilimleri beyin matrisinden kaldırmak için takılı tıraş bıçağını bir arada tutun ve arka kısmı geride bırakın. Forseps kullanarak, tıraş bıçağını birbirinden ayırın ve beyin dilimi yukarı bakacak şekilde düz, soğutulmuş yüzeye yerleştirin.
Prefrontal korteksi örneklemek için, koku alma pedinkülünü içeren ilk dilimin arkasındaki ikinci ve üçüncü dilimleri seçin. Bir doku zımba veya forseps kullanarak, istenen bölgeyi çıkarın. Mendili soğutulmuş tıraş bıçağının üzerine koyun ve eşit şekilde iki parçaya bölün.
Forsepsin ince ucunu kullanarak her dokuyu tıraş bıçağı üzerinde birden fazla dikey hareketle parçalara ayırın. Yapay beyin omurilik sıvısı içeren önceden soğutulmuş etiketli tüpü 30 mikrolitre BS3 çözeltisi veya araç çözeltisi ile yükseltin E.Sonra hemen kıyılmış dokuları istenen tüpe aktarın. Hipokampusu örneklemek için, beynin arka kısmını matristen çıkarın ve dorsal tarafı yukarı bakacak şekilde soğutulmuş düz bir yüzeye nemlendirilmiş filtre kağıdına yerleştirin.
Dorsal taraftan yaklaşan kavisli bir prob ve forseps ile, hipokampüsü her iki yarımküreden diseke edin, ardından dokuyu kıyın ve daha önce gösterildiği gibi uygun çivili tüplere aktarın. Çapraz bağlama reaksiyonu için, doku parçalarını küçük parçalara ayırmak için doku ve çözelti içeren tüpü ters çevirin. Tüp rotatördeki numuneleri 4 santigrat derecede 30 dakika ila 2 saat boyunca inkübe edin ve her tüp için BS3 inkübasyonunun başlangıç zamanını kaydedin.
Daha sonra reaksiyonu 78 mikrolitre bir molar glisin ile söndürün. Sabit rotasyonla 4 santigrat derecede 10 dakika daha inkübe edin ve söndürme için başlangıç ve bitiş zamanını kaydedin. BS3 çapraz bağlanmasından sonra batı leke analizinde, çapraz bağlı olmayan protein, GABA-A reseptörünün toplam alfa5-alt biriminin yaklaşık 55 kilodaltonda olduğunu gösterdi.
Bununla birlikte, BS3 çapraz bağlı proteini, GABA-A reseptörünün endomembranla ilişkili alfa5-alt biriminin, yaklaşık 55 kilodaltonda göç ettiğini ve GABA-A reseptörünün alfa5-alt birimine kovalent olarak çapraz bağlanmış protein komplekslerini temsil eden daha yüksek moleküler ağırlıklı protein türlerini göstermiştir. Ayrıca, GABA-A reseptör seviyelerinin yüzey alfa5-alt biriminde, prefrontal kortekste, stressiz kontrol farelerine kıyasla üç hafta ve beş haftalık KMYS'de anlamlı ve ilerleyici bir azalma gözlenmiştir. Reseptörlerin, ortam sıcaklığında plazma membran yüzeyi ile iç membran arasında mekik dokuduğu bilinmektedir.
Bu nedenle doku diseksiyonunun düşük sıcaklıkta yapılması önemlidir. Çapraz bağlama testi kullanılarak, psikososyal stresin, kısmen kaygı, davranış veya bilişsel eksiklikler için moleküler bir temel olarak hizmet eden GABA reseptörlerinin yüzey seviyelerini önemli ölçüde modüle edebileceği ortaya çıkmıştır.
