Il test di reticolazione chimica che utilizza BS3 come reticolante aiuterà a determinare il livello superficiale del recettore del neurotrasmettitore, che è un determinante critico dell'efficacia della neurotrasmissione. Questo test è particolarmente utile per la valutazione specifica della regione cerebrale delle dinamiche recettoriali in risposta a vari agenti psicotropi o modalità di stress psicogeno in modelli animali. Per iniziare, rimuovere rapidamente il cervello dal cranio del topo C57BL / 6J eutanasia.
Immergerlo in una capsula di Petri contenente PBS ghiacciato per 10-15 secondi. Posizionare il cervello raffreddato nella matrice cerebrale sul ghiaccio rivolto verso l'alto verso l'alto. Per tagliare il cervello coronalmente, inserire la prima lama di rasoio attraverso il bordo tra il bulbo olfattivo e il peduncolo olfattivo.
Utilizzando tre o quattro lamette da barba aggiuntive, tagliare in serie la parte anteriore del cervello coronalmente a intervalli di un millimetro. Tenere insieme le lamette inserite per sollevare le fette coronali dalla matrice cerebrale, lasciando la parte posteriore dietro. Usando una pinza, separare le lamette l'una dall'altra e posizionarle sulla superficie piatta e refrigerata con la fetta di cervello rivolta verso l'alto.
Per campionare la corteccia prefrontale, scegliere la seconda e la terza fetta posteriore alla prima fetta contenente il peduncolo olfattivo. Utilizzando un punch o una pinza di tessuto, rimuovere la regione desiderata. Metti il tessuto sulla lama del rasoio refrigerata e dividilo uniformemente in due pezzi.
Usa la punta sottile della pinza per tritare ogni tessuto in pezzi sulla lama del rasoio con più movimenti verticali. Spike il tubo marcato pre-raffreddato contenente liquido cerebrospinale artificiale con 30 microlitri di soluzione BS3 o soluzione veicolo E.Quindi trasferire immediatamente i tessuti tritati nel tubo desiderato. Per campionare l'ippocampo, rimuovere la parte posteriore del cervello dalla matrice e posizionarla su carta da filtro inumidita su una superficie piana refrigerata con il lato dorsale rivolto verso l'alto.
Con una sonda curva e una pinza che si avvicina dal lato dorsale, sezionare l'ippocampo da entrambi gli emisferi, quindi tritare il tessuto e trasferirlo in appropriati tubi chiodati come precedentemente dimostrato. Per la reazione di reticolazione, capovolgere il tubo contenente tessuto e soluzione per rompere i pezzi di tessuto in piccoli pezzi. Incubare i campioni sul rotatore del tubo a 4 gradi Celsius per 30 minuti a 2 ore e registrare l'ora di inizio dell'incubazione BS3 per ogni provetta.
Quindi estinguere la reazione con 78 microlitri di glicina molare. Incubare ulteriormente per 10 minuti a 4 gradi Celsius con rotazione costante e registrare l'ora di inizio e fine per la tempra. Nell'analisi western blot dopo crosslinking BS3, la proteina non reticolata ha mostrato la quantità totale di subunità alfa5 del recettore GABA-A a circa 55 kilodalton.
Tuttavia, la proteina reticolata BS3 ha mostrato che la subunità alfa5 associata all'endomembrana del recettore GABA-A migra a circa 55 kilodalton, insieme a specie proteiche a peso molecolare più elevato che rappresentano complessi proteici covalentemente reticolati alla subunità alfa5 del recettore GABA-A. Inoltre, una significativa e progressiva riduzione della subunità alfa5 di superficie dei livelli del recettore GABA-A è stata osservata nella corteccia prefrontale a tre settimane e cinque settimane di UCMS rispetto ai topi di controllo senza stress. I recettori sono noti per fare la spola tra la superficie della membrana plasmatica e la membrana interna a temperatura ambiente.
Quindi eseguire la dissezione dei tessuti a bassa temperatura è importante. Utilizzando il test di reticolazione, è stato rivelato che lo stress psicosociale può modulare significativamente i livelli superficiali dei recettori GABA che in parte funge da base molecolare per ansia, comportamento o deficit cognitivi.
