El ensayo de reticulación química utilizando BS3 como reticulante ayudará a determinar el nivel de superficie celular del receptor de neurotransmisores, que es un determinante crítico de la eficacia de la neurotransmisión. Este ensayo es particularmente útil para la evaluación específica de la región cerebral de la dinámica del receptor en respuesta a diversos agentes psicotrópicos o modalidades de estrés psicógeno en modelos animales. Para comenzar, retire rápidamente el cerebro del cráneo del ratón C57BL / 6J sacrificado.
Sumérjalo en una placa de Petri que contenga PBS helado durante 10 a 15 segundos. Coloque el cerebro frío en la matriz cerebral sobre hielo mirando hacia el lado ventral hacia arriba. Para cortar el cerebro coronalmente, inserte la primera hoja de afeitar a través del borde entre el bulbo olfatorio y el pedúnculo olfativo.
Usando de tres a cuatro cuchillas de afeitar adicionales, corte en serie la parte anterior del cerebro coronalmente a intervalos de un milímetro. Mantenga juntas las hojas de afeitar insertadas para levantar los cortes coronales de la matriz cerebral, dejando atrás la parte posterior. Usando fórceps, separe las hojas de afeitar entre sí y colóquelas en la superficie plana y fría con el corte cerebral hacia arriba.
Para tomar muestras de la corteza prefrontal, elija la segunda y tercera rebanadas posteriores a la primera rebanada que contiene el pedúnculo olfativo. Con un punzón de tejido o fórceps, retire la región deseada. Coloque el pañuelo en la hoja de afeitar fría y divídalo uniformemente en dos piezas.
Use la punta fina de las pinzas para picar cada tejido en pedazos en la hoja de afeitar con múltiples movimientos verticales. Pinche el tubo preenfriado marcado que contiene líquido cefalorraquídeo artificial con 30 microlitros de solución BS3 o solución de vehículo E.Luego transfiera inmediatamente los tejidos picados al tubo deseado. Para tomar muestras del hipocampo, retire la parte posterior del cerebro de la matriz y colóquela en papel de filtro humedecido sobre una superficie plana fría con el lado dorsal hacia arriba.
Con una sonda curva y fórceps acercándose desde el lado dorsal, disecciona el hipocampo desde ambos hemisferios, luego pica el tejido y transfiérelo a tubos con púas apropiados como se demostró anteriormente. Para la reacción de reticulación, invierta el tubo que contiene tejido y solución para romper los trozos de tejido en trozos pequeños. Incubar las muestras en el rotador del tubo a 4 grados centígrados durante 30 minutos a 2 horas y registrar la hora de inicio de la incubación BS3 para cada tubo.
Luego apague la reacción con 78 microlitros de una glicina molar. Incubar más durante 10 minutos a 4 grados centígrados con rotación constante y registrar la hora de inicio y finalización para el enfriamiento. En el análisis de Western blot después de la reticulación de BS3, la proteína no reticulada mostró la cantidad total de subunidad alfa5 del receptor GABA-A en aproximadamente 55 kilodaltons.
Sin embargo, la proteína reticulada BS3 mostró una subunidad alfa5 asociada a la endomembrana del receptor GABA-A migrando a aproximadamente 55 kilodaltons, junto con especies de proteínas de mayor peso molecular que representan complejos de proteínas reticuladas covalentemente a la subunidad alfa5 del receptor GABA-A. Además, se observó una reducción significativa y progresiva en la subunidad alfa5 de superficie de los niveles del receptor GABA-A en la corteza prefrontal a las tres semanas y cinco semanas de UCMS en comparación con los ratones de control sin estrés. Se sabe que los receptores se desplazan entre la superficie de la membrana plasmática y la membrana interna a temperatura ambiente.
Por lo tanto, es importante realizar la disección de tejidos a baja temperatura. Al utilizar el ensayo de reticulación, se reveló que el estrés psicosocial puede modular significativamente los niveles superficiales de los receptores GABA, que en parte sirve como base molecular para la ansiedad, el comportamiento o los déficits cognitivos.
