O ensaio químico de reticulação usando BS3 como um reticulante ajudará na determinação do nível de superfície celular do receptor do neurotransmissor, que é um determinante crítico da eficácia da transmissão neuro. Este ensaio é particularmente útil para a avaliação específica da região cerebral da dinâmica do receptor em resposta a vários agentes psicotrópicos ou modalidades de estresse psicogênico em modelos animais. Para começar, remova rapidamente o cérebro do crânio do camundongo C57BL/6J eutanasiado.
Submergir em uma placa de Petri contendo PBS gelado por 10 a 15 segundos. Coloque o cérebro resfriado na matriz cerebral no gelo voltado para o lado ventral para cima. Para cortar o cérebro coronalmente, insira a primeira lâmina de barbear através da borda entre o bulbo olfatório e o pedúnculo olfativo.
Usando três a quatro lâminas de barbear adicionais, corte em série a parte anterior do cérebro coronalmente em intervalos de um milímetro. Segure as lâminas de barbear inseridas juntas para levantar as fatias coronais da matriz cerebral, deixando a parte posterior para trás. Usando pinças, separe as lâminas de barbear umas das outras e coloque-as na superfície plana e gelada com a fatia cerebral voltada para cima.
Para amostrar o córtex pré-frontal, escolha o segundo e o terceiro cortes posteriores ao primeiro corte contendo o pedúnculo olfatório. Usando um punch de tecido ou pinça, remova a região desejada. Coloque o tecido sobre a lâmina de barbear gelada e divida uniformemente em dois pedaços.
Use a ponta fina da pinça para picar cada tecido em pedaços na lâmina de barbear com vários movimentos verticais. Cravar o tubo marcado pré-resfriado contendo líquido cefalorraquidiano artificial com 30 microlitros de solução BS3 ou solução veicular E.Em seguida, transfira imediatamente os tecidos picados para o tubo desejado. Para amostrar o hipocampo, remova a parte posterior do cérebro da matriz e coloque-a em papel de filtro umedecido em uma superfície plana resfriada com o lado dorsal voltado para cima.
Com uma sonda curva e pinça se aproximando do lado dorsal, disseque o hipocampo de ambos os hemisférios, em seguida, picar o tecido e transferi-lo para tubos pontilhados apropriados, como demonstrado anteriormente. Para reação de reticulação, inverta o tubo contendo tecido e solução para quebrar os pedaços de tecido em pequenos pedaços. Incubar as amostras no tubo rotador a 4 graus Celsius por 30 minutos a 2 horas e registrar o tempo de início da incubação BS3 para cada tubo.
Em seguida, extinguir a reação com 78 microlitros de glicina molar. Incubar ainda mais por 10 minutos a 4 graus Celsius com rotação constante e registrar o tempo de início e término para a têmpera. Na análise de western blot após a reticulação BS3, a proteína não-reticulada mostrou a quantidade total de alfa5-subunidade do receptor GABA-A em aproximadamente 55 quilodaltons.
No entanto, a proteína reticulada BS3 mostrou a subunidade alfa5-associada à endomembrana do receptor GABA-A migrando a aproximadamente 55 quilodaltons, juntamente com espécies proteicas de maior peso molecular representando complexos proteicos covalentemente reticulados à subunidade alfa5 do receptor GABA-A. Além disso, uma redução significativa e progressiva na subunidade alfa5 de superfície dos níveis do receptor GABA-A foi observada no córtex pré-frontal em três semanas e cinco semanas de UCMS em comparação com os camundongos controle sem estresse. Sabe-se que os receptores transitam entre a superfície da membrana plasmática e a membrana interna à temperatura ambiente.
Por isso, a realização da dissecção tecidual em baixa temperatura é importante. Utilizando o ensaio de crosslinking, foi revelado que o estresse psicossocial pode modular significativamente os níveis de superfície de receptores GABA que em parte serve como uma base molecular para ansiedade, comportamento, ou déficits cognitivos.
