Анализ химического сшивания с использованием BS3 в качестве сшивающего агента поможет определить уровень поверхности клеток рецептора нейротрансмиттера, который является критическим фактором, определяющим эффективность нейропередачи. Этот анализ особенно полезен для оценки динамики рецепторов в ответ на различные психотропные агенты или модальности психогенного стресса на животных модальностях. Для начала быстро удалите мозг из черепа усыпленной мыши C57BL/6J.
Погрузите его в чашку Петри, содержащую ледяной PBS, на 10-15 секунд. Поместите охлажденный мозг в мозговую матрицу на льду лицом к брюшной стороне вверх. Чтобы коронально разрезать мозг, вставьте первое лезвие бритвы через границу между обонятельной луковицей и обонятельной ножкой.
Используя три-четыре дополнительных бритвенных лезвия, последовательно разрезайте переднюю часть мозга коронально с интервалом в один миллиметр. Держите вставленные бритвенные лезвия вместе, чтобы поднять коронковые срезы с мозгового матрикса, оставив заднюю часть. Используя щипцы, отделите бритвенные лезвия друг от друга и поместите их на плоскую охлажденную поверхность срезом мозга вверх.
Чтобы взять образец префронтальной коры, выберите второй и третий срезы позади первого среза, содержащего обонятельную ножку. С помощью тканевого перфоратора или щипцов удалите нужную область. Положите салфетку на охлажденное лезвие бритвы и равномерно разделите его на две части.
Используйте тонкий кончик щипцов, чтобы измельчить каждую ткань на кусочки на лезвии бритвы несколькими вертикальными движениями. Добавьте в предварительно охлажденную меченую пробирку, содержащую искусственную спинномозговую жидкость, 30 микролитров раствора BS3 или раствора транспортного средства E. Затем немедленно переложите измельченные ткани в нужную пробирку. Чтобы взять образец гиппокампа, удалите заднюю часть мозга из матрицы и поместите ее на увлажненную фильтровальную бумагу на охлажденной плоской поверхности тыльной стороной вверх.
С изогнутым зондом и щипцами, приближающимися с дорсальной стороны, рассеките гиппокамп с обоих полушарий, затем измельчите ткань и перенесите ее в соответствующие трубки с шипами, как показано ранее. Для реакции сшивания инвертируйте трубку, содержащую ткань и раствор, чтобы разбить куски ткани на мелкие кусочки. Инкубируйте образцы на пробирочном вращателе при температуре 4 градуса Цельсия в течение от 30 минут до 2 часов и запишите время начала инкубации BS3 для каждой пробирки.
Затем погасите реакцию 78 микролитрами одного молярного глицина. Инкубируйте далее в течение 10 минут при температуре 4 градуса Цельсия при постоянном вращении и записывайте время начала и окончания закалки. В анализе вестерн-блоттинга после сшивания BS3 несшитый белок показал общее количество альфа5-субъединицы рецептора ГАМК-А примерно в 55 килодальтон.
Однако сшитый белок BS3 показал эндомембранную ассоциированную альфа5-субъединицу рецептора ГАМК-А, мигрирующую примерно со скоростью 55 килодальтон, наряду с более высокомолекулярными видами белка, представляющими белковые комплексы, ковалентно сшитые с альфа5-субъединицей рецептора ГАМК-А. Кроме того, значительное и прогрессирующее снижение поверхностных уровней альфа5-субъединицы рецептора ГАМК-А наблюдалось в префронтальной коре через три недели и пять недель UCMS по сравнению с мышами без контроля стресса. Известно, что рецепторы перемещаются между поверхностью плазматической мембраны и внутренней мембраной при температуре окружающей среды.
Поэтому важно выполнять рассечение тканей при низкой температуре. Используя анализ сшивания, было выявлено, что психосоциальный стресс может значительно модулировать поверхностные уровни рецепторов ГАМК, которые частично служат молекулярной основой для тревоги, поведения или когнитивного дефицита.
