Der chemische Vernetzungsassay, der BS3 als Vernetzer verwendet, wird bei der Bestimmung der Zelloberfläche des Neurotransmitterrezeptors helfen, die eine entscheidende Determinante für die Wirksamkeit der Neuroübertragung ist. Dieser Assay ist besonders nützlich für die hirnregionenspezifische Bewertung der Rezeptordynamik als Reaktion auf verschiedene psychotrope Substanzen oder psychogene Stressmodalitäten in Tiermodellen. Entfernen Sie zunächst schnell das Gehirn aus dem Schädel der euthanasierten C57BL/6J-Maus.
Tauchen Sie es für 10 bis 15 Sekunden in eine Petrischale mit eiskaltem PBS. Legen Sie das gekühlte Gehirn mit der Bauchseite nach oben in die Gehirnmatrix auf Eis. Um das Gehirn koronal zu durchtrennen, führen Sie die erste Rasierklinge durch die Grenze zwischen dem Riechkolben und dem Riechstiel.
Mit drei bis vier zusätzlichen Rasierklingen wird der vordere Teil des Gehirns in Abständen von einem Millimeter nacheinander koronal durchtrennt. Halte die eingesetzten Rasierklingen zusammen, um die koronalen Schnitte von der Hirnmatrix abzuheben und den hinteren Teil zurückzulassen. Trennen Sie die Rasierklingen mit einer Pinzette voneinander und legen Sie sie mit dem Hirnschnitt nach oben auf die flache, gekühlte Oberfläche.
Um den präfrontalen Kortex abzutasten, wählen Sie die zweite und dritte Schicht hinter der ersten Schicht, die den Riechstiel enthält. Entfernen Sie mit einem Taschentuchstanzer oder einer Pinzette die gewünschte Region. Legen Sie das Taschentuch auf die gekühlte Rasierklinge und teilen Sie es gleichmäßig in zwei Teile.
Verwenden Sie die feine Spitze der Pinzette, um jedes Gewebe auf der Rasierklinge mit mehreren vertikalen Bewegungen in Stücke zu schneiden. Füllen Sie das vorgekühlte etikettierte Röhrchen mit künstlichem Liquor mit 30 Mikrolitern BS3-Lösung oder Vehikellösung E. Übertragen Sie dann das zerkleinerte Gewebe sofort in das gewünschte Röhrchen. Um eine Probe aus dem Hippocampus zu nehmen, entfernen Sie den hinteren Teil des Gehirns aus der Matrix und legen Sie ihn mit der dorsalen Seite nach oben auf angefeuchtetes Filterpapier auf eine gekühlte, flache Oberfläche.
Mit einer gebogenen Sonde und einer Pinzette, die sich von der dorsalen Seite nähert, präparieren Sie den Hippocampus von beiden Hemisphären, zerkleinern Sie dann das Gewebe und übertragen Sie es wie zuvor gezeigt in geeignete stachelige Röhrchen. Für die Vernetzungsreaktion drehen Sie das Röhrchen mit Gewebe und Lösung um, um die Gewebestücke in kleine Stücke zu brechen. Inkubieren Sie die Proben auf dem Röhrchenrotator bei 4 Grad Celsius für 30 Minuten bis 2 Stunden und notieren Sie die Startzeit der BS3-Inkubation für jedes Röhrchen.
Anschließend wird die Reaktion mit 78 Mikrolitern eines molaren Glycins abgeschreckt. Weitere 10 Minuten bei 4 Grad Celsius unter ständiger Rotation inkubieren und die Start- und Endzeit für das Abschrecken aufzeichnen. In der Western-Blot-Analyse nach BS3-Vernetzung zeigte das unvernetzte Protein die Gesamtmenge der alpha5-Untereinheit des GABA-A-Rezeptors bei etwa 55 Kilodalton.
Das BS3-vernetzte Protein zeigte jedoch, dass die Endomembran-assoziierte alpha5-Untereinheit des GABA-A-Rezeptors bei etwa 55 Kilodalton wanderte, zusammen mit Proteinspezies mit höherem Molekulargewicht, die Proteinkomplexe repräsentieren, die kovalent mit der alpha5-Untereinheit des GABA-A-Rezeptors vernetzt sind. Darüber hinaus wurde im präfrontalen Kortex nach drei Wochen und fünf Wochen UCMS eine signifikante und fortschreitende Verringerung der Oberflächen-alpha5-Untereinheit des GABA-A-Rezeptors im Vergleich zu den stressfreien Kontrollmäusen beobachtet. Es ist bekannt, dass die Rezeptoren bei Umgebungstemperatur zwischen der Oberfläche der Plasmamembran und der inneren Membran pendeln.
Daher ist es wichtig, eine Gewebedissektion bei niedriger Temperatur durchzuführen. Durch die Verwendung von Crosslinking-Assays konnte gezeigt werden, dass psychosozialer Stress die Oberflächenkonzentration von GABA-Rezeptoren signifikant modulieren kann, was teilweise als molekulare Grundlage für Angst, Verhalten oder kognitive Defizite dient.
