BS3를 가교제로 사용하는 화학적 가교 분석은 신경 전달 효능의 중요한 결정 요인인 신경 전달 물질 수용체 세포 표면 수준을 결정하는 데 도움이 됩니다. 이 분석은 동물 모델에서 다양한 향정신성 제제 또는 심인성 스트레스 양식에 반응하는 수용체 역학의 뇌 영역 특이적 평가에 특히 유용합니다. 시작하려면 안락사된 C57BL/6J 마우스의 두개골에서 뇌를 빠르게 제거합니다.
얼음처럼 차가운 PBS가 들어 있는 페트리 접시에 10-15초 동안 담그십시오. 식힌 뇌를 복부 쪽이 위로 향하도록 얼음 위의 뇌 매트릭스에 놓습니다. 뇌를 관상 모양으로 자르려면 첫 번째 면도날을 후각 구근과 후각 꽃자루 사이의 경계를 통해 삽입합니다.
3-4 개의 추가 면도날을 사용하여 뇌의 앞쪽 부분을 1 밀리미터 간격으로 관상 적으로 연속적으로 자릅니다. 삽입된 면도날을 함께 잡고 뇌 매트릭스에서 관상 조각을 들어 올리고 뒤쪽 부분은 남겨둡니다. 집게를 사용하여 면도날을 서로 분리하고 뇌 조각이 위를 향하도록 평평하고 차가운 표면에 놓습니다.
전두엽 피질을 샘플링하려면 후각 꽃자루를 포함하는 첫 번째 조각의 뒤쪽에 있는 두 번째 및 세 번째 조각을 선택합니다. 티슈 펀치 또는 집게를 사용하여 원하는 부위를 제거하십시오. 식힌 면도날에 티슈를 올려 놓고 두 조각으로 골고루 나눕니다.
집게의 미세한 끝을 사용하여 면도날에서 여러 수직 동작으로 각 조직을 조각으로 다집니다. 인공 뇌척수액이 들어있는 미리 냉장 된 라벨이 붙은 튜브에 30 마이크로 리터의 BS3 용액 또는 비히클 용액 E. 그런 다음 다진 조직을 원하는 튜브로 즉시 옮깁니다. 해마를 샘플링하려면 매트릭스에서 뇌의 뒤쪽 부분을 제거하고 등쪽이 위를 향하도록 차갑고 평평한 표면에 축축한 여과지 위에 놓습니다.
구부러진 탐침과 집게가 등쪽에서 접근하여 양쪽 반구에서 해마를 해부한 다음 조직을 다져서 이전에 시연된 대로 적절한 스파이크 튜브로 옮깁니다. 가교 반응을 위해 조직과 용액이 들어 있는 튜브를 뒤집어 조직 덩어리를 작은 조각으로 나눕니다. 샘플 샘플을 섭씨 4도에서 30분에서 2시간 동안 튜브 회전자에서 배양하고 각 튜브에 대한 BS3 배양 시작 시간을 기록합니다.
그런 다음 78 마이크로 리터의 1 몰 글리신으로 반응을 종결시킵니다. 일정한 회전으로 섭씨 4도에서 10분 동안 더 배양하고 담금질 시작 및 종료 시간을 기록합니다. BS3 가교 후 웨스턴 블롯 분석에서, 비 가교 단백질은 약 55 킬로 달톤에서 GABA-A 수용체의 알파 5- 서브 유닛의 총량을 보였다.
그러나, BS3 가교 단백질은 GABA-A 수용체의 알파5 서브유닛에 공유 가교된 단백질 복합체를 나타내는 더 높은 분자량 단백질 종과 함께 약 55킬로달톤에서 이동하는 GABA-A 수용체의 막내 관련 알파5-서브유닛을 보여주었다. 더욱이, GABA-A 수용체 수준의 표면 알파5-서브유닛의 현저하고 점진적인 감소가 스트레스가 없는 대조군 마우스와 비교하여 UCMS의 3주 및 5주에 전두엽 피질에서 관찰되었습니다. 수용체는 주변 온도에서 원형질막 표면과 내부 막 사이를 왕복하는 것으로 알려져 있습니다.
따라서 저온에서 조직 해부를 수행하는 것이 중요합니다. 가교 분석을 활용함으로써 심리사회적 스트레스가 부분적으로 불안, 행동 또는 인지 결핍의 분자적 기초 역할을 하는 GABA 수용체의 표면 수준을 크게 조절할 수 있음이 밝혀졌습니다.
