架橋剤としてBS3を用いた化学架橋アッセイは、神経伝達の有効性の重要な決定要因である神経伝達物質受容体細胞表面レベルの決定に役立ちます。このアッセイは、動物モデルにおける様々な向精神薬または心因性ストレスモダリティに応答する受容体動態の脳領域特異的評価に特に有用である。まず、安楽死させたC57BL/6Jマウスの頭蓋骨から脳を急速に取り除きます。
氷冷したPBSを含むペトリ皿に10〜15秒間沈めます。冷やした脳を、腹側を上にして氷の上の脳マトリックスに置きます。脳を冠状に切断するには、最初のかみそりの刃を嗅球と嗅茎の境界に挿入します。
3〜4枚の追加のかみそりの刃を使用して、脳の前部を1ミリメートル間隔で冠状に連続的に切断します。挿入したかみそりの刃を一緒に保持して、冠状スライスを脳マトリックスから持ち上げ、後部を残します。鉗子を使用して、かみそりの刃を互いに分離し、脳スライスを上に向けて平らで冷やした表面に置きます。
前頭前野をサンプリングするには、嗅柄を含む最初のスライスの後方にある2番目と3番目のスライスを選択します。ティッシュパンチまたは鉗子を使用して、目的の領域を取り除きます。冷やしたかみそりの刃の上にティッシュを置き、均等に2つに分けます。
鉗子の細い先端を使用して、複数の垂直方向の動きでかみそりの刃で各組織を細かく刻みます。人工脳脊髄液を含む予め冷却した標識チューブに30マイクロリットルのBS3溶液またはビヒクル溶液Eをスパイクし、次に直ちにミンチ組織を目的のチューブに移す。海馬をサンプリングするには、マトリックスから脳の後部を取り除き、背側を上に向けて冷やした平らな面の湿らせたろ紙の上に置きます。
湾曲したプローブと鉗子を背側から近づけて、海馬を両方の半球から解剖し、次に組織を細かく刻み、前述のように適切なスパイクチューブに移します。架橋反応のために、組織と溶液を含むチューブを反転させて、組織チャンクを小さな断片に分割します。チューブローテーター上でサンプルを摂氏4度で30分から2時間インキュベートし、各チューブのBS3インキュベーションの開始時間を記録します。
次に、78マイクロリットルの1モルグリシンで反応を停止します。一定の回転で摂氏4度でさらに10分間インキュベートし、クエンチの開始時間と終了時間を記録します。BS3架橋後のウェスタンブロット解析では、非架橋タンパク質は、約55キロダルトンでGABA-A受容体のα5サブユニットの総量を示した。
しかし、BS3架橋タンパク質は、GABA-A受容体の膜内会合α5サブユニットが約55キロダルトンで移動し、GABA-A受容体のα5サブユニットに共有結合で架橋されたタンパク質複合体を表す高分子量タンパク質種を示しました。さらに、GABA-A受容体レベルの表面α5サブユニットの有意かつ漸進的な減少は、ストレスのない対照マウスと比較して、UCMSの3週間および5週間で前頭前野で観察されました。受容体は、周囲温度で原形質膜表面と内膜の間を往復することが知られています。
したがって、低温で組織解剖を行うことが重要です。架橋アッセイを利用することにより、心理社会的ストレスがGABA受容体の表面レベルを有意に調節し、不安、行動、または認知障害の分子基盤として部分的に機能することが明らかになりました。
