Le test de réticulation chimique utilisant BS3 comme agent de réticulation aidera à déterminer le niveau de surface de la cellule du récepteur des neurotransmetteurs, qui est un déterminant critique de l’efficacité de la transmission neurologique. Ce test est particulièrement utile pour l’évaluation spécifique de la dynamique des récepteurs spécifiques à la région du cerveau en réponse à divers agents psychotropes ou modalités de stress psychogène dans des modèles animaux. Pour commencer, retirez rapidement le cerveau du crâne de la souris C57BL/6J euthanasiée.
Immergez-le dans une boîte de Petri contenant du PBS glacé pendant 10 à 15 secondes. Placez le cerveau refroidi dans la matrice cérébrale sur de la glace face au côté ventral vers le haut. Pour couper le cerveau coronallement, insérez la première lame de rasoir à travers la bordure entre le bulbe olfactif et le pédoncule olfactif.
À l’aide de trois à quatre lames de rasoir supplémentaires, coupez en série la partie antérieure du cerveau coronalement à des intervalles d’un millimètre. Tenez les lames de rasoir insérées ensemble pour soulever les tranches coronales de la matrice cérébrale, en laissant la partie postérieure derrière. À l’aide de pinces, séparez les lames de rasoir les unes des autres et placez-les sur la surface plane et refroidie, la tranche de cerveau tournée vers le haut.
Pour échantillonner le cortex préfrontal, choisissez les deuxième et troisième tranches postérieures à la première tranche contenant le pédoncule olfactif. À l’aide d’un poinçon ou d’une pince en tissu, retirez la région souhaitée. Placez le mouchoir sur la lame de rasoir réfrigérée et divisez-le uniformément en deux morceaux.
Utilisez la pointe fine de la pince pour hacher chaque tissu en morceaux sur la lame de rasoir avec de multiples mouvements verticaux. Piquez le tube étiqueté pré-réfrigéré contenant du liquide céphalorachidien artificiel avec 30 microlitres de solution BS3 ou de solution de véhicule E.Puis transférez immédiatement les tissus hachés dans le tube souhaité. Pour prélever l’hippocampe, retirez la partie postérieure du cerveau de la matrice et placez-la sur du papier filtre humidifié sur une surface plane refroidie avec la face dorsale vers le haut.
Avec une sonde incurvée et une pince s’approchant du côté dorsal, disséquez l’hippocampe des deux hémisphères, puis hachez le tissu et transférez-le dans des tubes à pointes appropriés comme démontré précédemment. Pour la réaction de réticulation, inverser le tube contenant le tissu et la solution pour briser les morceaux de tissu en petits morceaux. Incuber les échantillons sur le rotateur tubulaire à 4 degrés Celsius pendant 30 minutes à 2 heures et noter l’heure de début de l’incubation BS3 pour chaque tube.
Ensuite, éteignez la réaction avec 78 microlitres d’une molaire de glycine. Incuber davantage pendant 10 minutes à 4 degrés Celsius avec une rotation constante et noter l’heure de début et de fin de la trempe. Dans l’analyse par transfert Western après réticulation de BS3, la protéine non réticulée a montré la quantité totale de sous-unité alpha5 du récepteur GABA-A à environ 55 kilodaltons.
Cependant, la protéine réticulée BS3 a montré que la sous-unité alpha5 du récepteur GABA-A associée à l’endomembrane migrait à environ 55 kilodaltons, ainsi que des espèces de protéines de poids moléculaire plus élevé représentant des complexes protéiques réticulés par covalence à la sous-unité alpha5 du récepteur GABA-A. De plus, une réduction significative et progressive de la sous-unité alpha5 de surface des niveaux de récepteurs GABA-A a été observée dans le cortex préfrontal à trois semaines et cinq semaines d’UCMS par rapport aux souris témoins sans stress. Les récepteurs sont connus pour faire la navette entre la surface de la membrane plasmique et la membrane interne à température ambiante.
Il est donc important d’effectuer une dissection tissulaire à basse température. En utilisant le test de réticulation, il a été révélé que le stress psychosocial peut moduler de manière significative les niveaux de surface des récepteurs GABA, ce qui sert en partie de base moléculaire à l’anxiété, au comportement ou aux déficits cognitifs.
