בדיקת הקרוסלינקינג הכימית באמצעות BS3 כקרוסלינקר תסייע בקביעת רמת פני השטח של תא הקולטן הנוירוטרנסמיטר, שהוא גורם מכריע ביעילות ההולכה העצבית. בדיקה זו שימושית במיוחד עבור הערכה ספציפית לאזור המוח של דינמיקת קולטנים בתגובה לסוכנים פסיכוטרופיים שונים או שיטות לחץ פסיכוגניות במודלים של בעלי חיים. כדי להתחיל, הסר במהירות את המוח מהגולגולת של עכבר C57BL/6J שעבר המתת חסד.
טבלו אותו בצלחת פטרי המכילה PBS קר כקרח למשך 10 עד 15 שניות. הניחו את המוח המצונן לתוך מטריצת המוח על קרח הפונה לצד הגחוני כלפי מעלה. כדי לחתוך את המוח באופן קורונלי, הכנס את סכין הגילוח הראשון דרך הגבול בין נורת הריח לבין פדונקל הריח.
באמצעות שלושה עד ארבעה סכיני גילוח נוספים, חתכו באופן סדרתי את החלק הקדמי של המוח באופן קורונלי במרווחים של מילימטר אחד. החזיקו את סכיני הגילוח המוחדרים יחד כדי להרים את פרוסות העטרה ממטריצת המוח, ומשאירים את החלק האחורי מאחור. בעזרת מלקחיים, מפרידים את סכיני הגילוח זה מזה ומניחים אותם על המשטח השטוח והצונן כשפרוסת המוח פונה כלפי מעלה.
כדי לדגום את קליפת המוח הקדם-מצחית, בחרו את הפרוסה השנייה והשלישית אחורית לפרוסה הראשונה המכילה את פדונקל הריח. באמצעות אגרוף רקמות או מלקחיים, להסיר את האזור הרצוי. שים את הרקמה על סכין הגילוח המצונן ולחלק אותו באופן שווה לשני חלקים.
השתמש בקצה העדין של המלקחיים כדי לטחון כל רקמה לחתיכות על סכין הגילוח בתנועות אנכיות מרובות. ספייק את הצינור המסומן מראש המכיל נוזל מוחי מלאכותי עם 30 מיקרוליטר של תמיסת BS3 או פתרון רכב E.ואז מיד להעביר את הרקמות הטחונות לתוך הצינור הרצוי. כדי לדגום את ההיפוקמפוס, הסירו את החלק האחורי של המוח מהמטריצה והניחו אותו על נייר סינון לח על משטח שטוח ומצונן כשהצד הגבי פונה כלפי מעלה.
עם בדיקה מעוקלת ומלקחיים המתקרבים מהצד הגבי, נתחו את ההיפוקמפוס משני חצאי הכדור, ואז טחנו את הרקמה והעבירו אותה לצינורות קוצים מתאימים כפי שהודגם בעבר. לתגובת crosslinking, הפוך את הצינור המכיל רקמה ותמיסה כדי לשבור את גושי הרקמה לחתיכות קטנות. לדגור את הדגימות על מסובב הצינור ב 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות עד שעתיים ולרשום את זמן ההתחלה של דגירה BS3 עבור כל צינור.
ואז להרוות את התגובה עם 78 מיקרוליטר של גליצין טוחנת אחת. יש לדגור עוד במשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם סיבוב קבוע ולתעד את זמן ההתחלה והסיום למרווה. בניתוח הכתם המערבי לאחר הצלבת BS3, החלבון שאינו מוצלב הראה את הכמות הכוללת של אלפא5-תת-יחידה של קולטן GABA-A בכ-55 קילודלטון.
עם זאת, החלבון הצולב-מקושר BS3 הראה תת-יחידה אלפא-5 של קולטן GABA-A הקשורה לרירית הרחם הנודדת בכ-55 קילודלטון, יחד עם מיני חלבונים בעלי משקל מולקולרי גבוה יותר המייצגים קומפלקסים חלבוניים מוצלבים באופן קוולנטי לתת-יחידה אלפא-5 של קולטן GABA-A. יתר על כן, ירידה משמעותית והדרגתית בתת-יחידה אלפא-5 של פני השטח של רמות קולטן GABA-A נצפתה בקליפת המוח הקדם-מצחית לאחר שלושה שבועות וחמישה שבועות של UCMS בהשוואה לעכברי הבקרה ללא לחץ. הקולטנים ידועים כנעים בין פני השטח של קרום הפלזמה לבין הממברנה הפנימית בטמפרטורת הסביבה.
לכן חשוב לבצע דיסקציה של רקמות בטמפרטורה נמוכה. על ידי שימוש בבדיקת crosslinking, התגלה כי לחץ פסיכו-סוציאלי יכול לווסת באופן משמעותי את רמות פני השטח של קולטני GABA אשר משמשים בחלקם כבסיס מולקולרי לחרדה, התנהגות או ליקויים קוגניטיביים.
