نطاق بحثنا في هذا المجال من تكوين أعضاء الكبد. السؤال الذي نحاول الإجابة عليه هو كيف يصبح الكبد كبيرا جدا ويستخدمه في نهج الهندسة العكسية لبناء أنسجة الكبد من الخلايا الجذعية. أحدث التطورات في مجال الطب التجديدي للكبد هي في مجال التصغير.
نحن نستخدم الخلايا الجذعية لصنع أنسجة مصغرة تكرر العضو الفعلي ، وبهذه الطريقة ، يمكننا دراسة تكوين الأعضاء وبيولوجيا الأعضاء. يحتوي مختبرنا على العديد من النتائج المهمة في مجال الطب التجديدي للكبد. باستخدام بعض تقنيات التصغير هذه ، حددنا الخطوات الرئيسية أثناء تكوين أعضاء الكبد ، بما في ذلك التشكل وهجرة الخلايا.
وهذه إحدى النتائج الرئيسية التي توصلنا إليها في هذا المجال. تتيح مزايا بروتوكولنا في هذا المنشور العديد من التقنيات العضوية المختلفة أثناء التصغير. لذلك يمكننا الآن دراسة عمليات مثل التشكل المتفرع والجوانب الأخرى للهجرة في أنسجة الكبد المصغرة التي لا يمكن لأي تقنية أخرى توفيرها.
أسئلة البحث التي سنطرحها في المستقبل ، بسبب العمل الذي قمنا به حتى الآن ، تتعلق بكيفية نمو وهجرة الخلايا ، وكيف يتم تنسيق ذلك؟ وسنسأل أيضا عن الآليات التي يمكننا من خلالها تجميع الأنسجة في أنسجة أكبر تشبه الكبد. للبدء ، قم بزراعة الخلايا البرية من النوع البري للورم الأرومي الكبدي HepG2 البشري في قارورة T75 عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، وتغيير الوسط يوميا.
عند الوصول إلى 80٪ من التقاء ، اشطف الخلايا باستخدام PBS. بعد التخلص من PBS ، احتضان الخلايا بخمسة ملليلتر من 0.05٪ من التربسين EDTA. ثم أضف كميات متساوية من cDMEM لغسل الخلايا من القارورة.
بمجرد انفصال الخلايا ، انقل الخليط إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي معقم سعة 15 مليلتر وقم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 300 جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد إعادة تعليق الخلايا في cDMEM ، عد الخلايا لتحديد التركيز النهائي في الخلايا لكل مليلتر. لتسمية الخلايا ، قم بتدويرها عند 300 جم لمدة خمس دقائق في أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا.
أعد تعليق الحبيبات في وسط نمو خال من المصل لتحقيق تركيز نهائي واحد في 10 إلى قوة ست خلايا لكل مليلتر واحتضانها بخمسة ميكرولترات من محلول وضع العلامات على الخلايا الفلورية لكل مليلتر من تعليق الخلية عند الدوران. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 450 جم لمدة خمس دقائق وأعد تعليق حبيبات الخلية في cDMEM الطازج. لتكوين كروي ، امزج تعليق الخلية جيدا وقم بتوزيع 100 ميكرولتر من تعليق الخلية على كل بئر من اللوحة المغلفة ب 96 بئر.
قم بالطرد المركزي للوحة عند 340 جم لمدة 10 دقائق واحتضانها عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة خمسة إلى تسعة أيام. يتم ضغط الكرويات الكبدية ، بغض النظر عن الحجم ، بالكامل بحلول اليوم الخامس ، وتنتقل من الشفافة إلى المعتمة عندما تصبح سميكة. للبدء ، احصل على كرويات كبدية ووسيطة في 96 لوحة بئر.
باستخدام ماصة ، اجمع الخلايا الليفية للقلفة البشرية أو الكرويات HFF MRC-5 بشكل فردي في أنبوب طرد مركزي مخروطي معقم سعة 15 مليلتر يحتوي على cDMEM جديد. احتضن الكرات لمدة خمس دقائق على الثلج للسماح لها بالاستقرار ، ثم اشطفها برفق باستخدام cDMEM الدافئ. باستخدام ماصة، انقل كرويا واحدا من الورم الأرومي الكبدي G2 من النوع البري من HFF برفق إلى بئر يحتوي على كروي من النوع البري من الورم الأرومي الكبدي البشري G2.
احتضان الكرويات مع عامل النمو المثلج البارد الذي قلل من Matrigel في تخفيف 1: 1. ثم أضف 75 ميكرولترا من cDMEM الطازج إلى كل بئر واحتضنه عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة يومين إلى ثلاثة أيام. أكد الفحص المجهري الفلوري وتحليل الصور أن تكوين التجميع كان ناجحا عبر مصفوفات ووسائط مختلفة ، على الرغم من ملاحظة اختلافات مورفولوجية طفيفة.
كشف مزيد من التحليل أن القرب الأقرب من الكرويات أدى إلى أوقات ضغط أسرع. للبدء ، احصل على الكرات الكبدية من الخلايا البرية من الورم الأرومي الكبدي البشري G2. اجمع الكرات بشكل فردي في جهاز طرد مركزي مخروطي معقم سعة 15 مليلتر ، وضع الأنبوب على الجليد للسماح للكرات بالاستقرار.
ثم استنشق الوسط من الأنبوب بعناية. في أنبوب معقم منفصل سعة 15 ملليلتر ، امزج ملليلترا واحدا من عامل النمو المثلج البارد الذي يقلل من Matrigel أو GFR MG ووسط نمو التحكم في الجليد البارد عند تخفيف 1: 1. أضف المزيج إلى الأنبوب الذي يحتوي على الكرويات ، مما يضمن توزيعا كرويا متساويا.
باستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر ، اجمع 15 ميكرولترا من كروي واحد في محلول MG وقم بزرعها ببطء في طبق بتري سعة 60 ملم. بعد ذلك ، احتضان القطرات عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 60 دقيقة وأضف ببطء خمسة ملليلتر من وسط النمو المطلوب إلى طبق بتري. طورت كرويات سبدية الكبد خيوطا مهاجرة سميكة بارزة باتجاه مجموعات الخلايا الليفية بحلول اليوم التاسع.
للبدء ، قم بحصاد الخلايا الليفية للقلفة البشرية ، أو خلايا HFF MRC-5 ، وبذرها في قارورة معالجة بزراعة الأنسجة T75 بكثافة 5،000 خلية لكل سنتيمتر مربع. احتضان القارورة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 72 ساعة في 15 مل من cDMEM. بعد ذلك ، اجمع الوسائط المكيفة باللحمة المتوسطة ، أو M-CM ، في أنبوب مخروطي معقم سعة 15 مليلتر وقم بطردها عند 290 جم لمدة خمس دقائق لإزالة الحطام.
قم بتصفية المادة الطافية بفلتر 0.2 ميكرومتر للتعقيم واحتفظ بالمرشح. بعد ذلك ، قم بتخفيف M-CM بوسط نمو كامل بنسبة تخفيف تصل إلى 1: 7 للتجربة المطلوبة. قم بتعليق خلايا HFF MRC-5 في cDMEM الطازج لتحقيق تركيز نهائي ستة أضعاف 10 إلى قوة خمس خلايا لكل مليلتر ووضع الأنبوب على الجليد.
امزج معلق الخلية وعامل النمو المثلج يقلل من Matrigel أو كولاجين ذيل الفئران في تخفيف 1: 1. انقل 100 ميكرولتر من محلول HFF MRC-5 و Matrigel إلى بئر يحتوي على كروي كبدي واحتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 30 دقيقة. أخيرا ، أضف 75 ميكرولترا من cDMEM الطازج إلى كل بئر واحتضنه لمدة تصل إلى 12 يوما.
تم تحفيز الهجرة الجماعية بشكل فعال في المختبر باستخدام تكوين قطرات من الكرات الكبدية مع M-CM. عززت التأثيرات المعتمدة على التركيز ل M-CM ظهور خيوط خلوية وتفرع من الكرويات. بحلول اليوم الحادي عشر ، أصبحت النتوءات الخلوية من الكرات أكثر وضوحا ، وشكلت صفائح مترابطة.
