Der Schwerpunkt unserer Forschung liegt auf diesem Gebiet der Leberorganogenese. Die Frage, die wir zu beantworten versuchen, ist, wie die Leber so groß wird und sie in einem Reverse-Engineering-Ansatz verwendet, um Lebergewebe aus Stammzellen aufzubauen. Die jüngsten Entwicklungen auf unserem Gebiet der regenerativen Lebermedizin liegen im Bereich der Miniaturisierung.
Wir verwenden Stammzellen, um Miniaturgewebe herzustellen, die das eigentliche Organ nachbilden, und auf diese Weise können wir die Organbildung und die Organbiologie untersuchen. Unser Labor hat mehrere bedeutende Erkenntnisse auf unserem Gebiet der regenerativen Lebermedizin. Durch den Einsatz einiger dieser Miniaturisierungstechniken haben wir Schlüsselschritte während der Leberorganogenese identifiziert, einschließlich der Morphogenese und der Zellmigration.
Und das ist eine unserer wichtigsten Erkenntnisse auf diesem Gebiet. Die Vorteile unseres Protokolls in dieser Veröffentlichung ermöglichen verschiedene Organoid-Techniken während der Miniaturisierung. Im Wesentlichen können wir jetzt also Prozesse wie Verzweigung, Morphogenese und andere Aspekte der Migration in einem Miniatur-Lebergewebe untersuchen, die keine andere Technik bieten kann.
Die Forschungsfragen, die wir uns aufgrund unserer bisherigen Arbeit in Zukunft stellen werden, beziehen sich darauf, wie das Wachstum und die Wanderung der Zellen koordiniert werden. Und wir werden auch nach Mechanismen fragen, mit denen wir Gewebe zu größeren Geweben zusammensetzen können, die der Leber ähneln. Kultivieren Sie zu Beginn HepG2-Wildtyp-Zellen des menschlichen Hepatoblastoms in einem T75-Kolben bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid und wechseln Sie das Medium täglich.
Bei Erreichen einer Konfluenz von 80 % spülen Sie die Zellen mit PBS. Nachdem Sie das PBS verworfen haben, inkubieren Sie die Zellen mit fünf Millilitern 0,05 % Trypsin-EDTA. Fügen Sie dann gleiche Mengen cDMEM hinzu, um die Zellen aus dem Kolben zu waschen.
Sobald sich die Zellen abgelöst haben, geben Sie die Mischung in ein steriles konisches 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie die Zellsuspension fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 300 g. Nachdem Sie die Zellen in cDMEM resuspendiert haben, zählen Sie die Zellen, um die endgültige Konzentration in Zellen pro Milliliter zu bestimmen. Um die Zellen zu markieren, drehen Sie sie fünf Minuten lang bei 300 g in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen.
Resuspendieren Sie das Pellet in einem serumfreien Wachstumsmedium, um eine Endkonzentration von eins mal 10 hoch sechs Zellen pro Milliliter zu erreichen, und inkubieren Sie es mit fünf Mikrolitern fluoreszierender Zellmarkierungslösung pro Milliliter Zellsuspension in der Rotation. Als nächstes zentrifugieren Sie die Zellsuspension fünf Minuten lang bei 450 g und resuspendieren das Zellpellet in frischem cDMEM. Für die Sphäroidbildung mischen Sie die Zellsuspensionsvertiefung und geben Sie 100 Mikroliter Zellsuspension in jede Vertiefung der Agarose-beschichteten 96-Well-Platte.
Zentrifugieren Sie die Platte 10 Minuten lang bei 340 g und inkubieren Sie sie fünf bis neun Tage lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid. Leber-Sphäroide, unabhängig von ihrer Größe, verdichteten sich am fünften Tag vollständig und gingen mit zunehmender Verdickung von durchscheinend zu undurchsichtig über. Zu Beginn erhalten Sie hepatische und mesenchymale Sphäroide in 96-Well-Platten.
Sammeln Sie mit einer Pipette humane Vorhautfibroblasten oder HFF MRC-5-Sphäroide einzeln in ein steriles konisches 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, das frisches cDMEM enthält. Inkubieren Sie die Sphäroide fünf Minuten lang auf Eis, damit sie sich absetzen können, und spülen Sie sie dann vorsichtig mit warmem cDMEM ab. Übertragen Sie mit einer Pipette vorsichtig ein einzelnes HFF MRC-5-Sphäroid in eine Vertiefung, die ein humanes Hepatoblastom-G2-Wildtyp-Sphäroid enthält.
Inkubieren Sie die Sphäroide mit eiskaltem Wachstumsfaktor reduziertem Matrigel in einer 1:1-Verdünnung. Geben Sie dann 75 Mikroliter frisches cDMEM in jede Vertiefung und inkubieren Sie zwei bis drei Tage lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid. Fluoreszenzmikroskopie und Bildanalyse bestätigten, dass die Assembloidbildung über verschiedene Matrizen und Medien hinweg erfolgreich war, obwohl leichte morphologische Unterschiede festgestellt wurden.
Weitere Analysen zeigten, dass eine größere Nähe der Sphäroide zu schnelleren Verdichtungszeiten führte. Gewinnen Sie zunächst hepatische Sphäroide aus humanen Hepatoblastom-G2-Wildtyp-Zellen. Sammeln Sie die Sphäroide einzeln in einer sterilen konischen 15-Milliliter-Zentrifuge und legen Sie das Röhrchen auf Eis, damit sich die Sphäroide absetzen können.
Saugen Sie dann das Medium vorsichtig aus dem Rohr ab. Mischen Sie in einem separaten sterilen 15-Milliliter-Röhrchen einen Milliliter eiskaltes Wachstumsfaktor-reduziertes Matrigel oder GFR MG und eiskaltes Kontrollwachstumsmedium in einer Verdünnung von 1:1. Geben Sie die Mischung in das Röhrchen mit den Sphäroiden und sorgen Sie für eine gleichmäßige Verteilung der Sphäroide.
Sammeln Sie mit einer 200-Mikroliter-Pipette 15 Mikroliter eines einzelnen Sphäroids in der MG-Lösung und säen Sie es langsam auf eine 60-Millimeter-Petrischale. Inkubieren Sie dann die Tröpfchen bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid für 60 Minuten und geben Sie langsam fünf Milliliter des gewünschten Wachstumsmediums in die Petrischale. Hepatitis-Sphäroide entwickelten am neunten Tag dicke wandernde Stränge, die in Richtung der Fibroblastencluster hinausragten.
Zu Beginn werden humane Vorhautfibroblasten oder HFF MRC-5-Zellen entnommen und in einen mit T75-Gewebekultur behandelten Kolben mit einer Dichte von 5.000 Zellen pro Quadratzentimeter ausgesät. Der Kolben wird 72 Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid in 15 Millilitern cDMEM inkubiert. Sammeln Sie anschließend das mesenchymalkonditionierte Medium oder M-CM in einem sterilen konischen 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie es fünf Minuten lang bei 290 G, um Schmutz zu entfernen.
Filtern Sie den Überstand zur Sterilisation mit einem 0,2-Mikrometer-Filter und halten Sie das Filtrat zurück. Verdünnen Sie dann das M-CM mit vollständigem Wachstumsmedium bei einem Verdünnungsverhältnis von bis zu 1:7 für das gewünschte Experiment. Suspendieren Sie die HFF MRC-5-Zellen in frischem cDMEM, um eine Endkonzentration von sechsmal 10 hoch fünf Zellen pro Milliliter zu erreichen, und stellen Sie das Röhrchen auf Eis.
Mischen Sie die Zellsuspension und das eiskalte Wachstumsfaktor reduziertes Matrigel oder Rattenschwanzkollagen in 1:1 Verdünnung. Übertragen Sie 100 Mikroliter HFF MRC-5 und Matrigel-Lösung in eine Vertiefung, die ein Lebersphäroid enthält, und inkubieren Sie die Platte 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid. Zum Schluss geben Sie 75 Mikroliter frisches cDMEM in jede Vertiefung und inkubieren Sie bis zu 12 Tage lang.
Die kollektive Migration wurde in vitro durch Tröpfchenbildung von hepatischen Sphäroiden mit M-CM effektiv induziert. Die konzentrationsabhängige Wirkung von M-CM begünstigte die Entstehung von Zellsträngen und die Verzweigung von den Sphäroiden aus . Am 11. Tag wurden die zellulären Vorsprünge der Sphäroide ausgeprägter und bildeten miteinander verbundene Schichten.
