El alcance de nuestra investigación se centra en esta área de la organogénesis hepática. La pregunta que estamos tratando de responder es cómo el hígado se vuelve tan grande y lo usa en un enfoque de ingeniería inversa para construir tejido hepático a partir de células madre. Los desarrollos más recientes en nuestro campo de la medicina regenerativa hepática se encuentran en el área de la miniaturización.
Estamos utilizando células madre para hacer tejidos en miniatura que replican el órgano real, y de esta manera, podemos estudiar la formación de órganos y la biología de los órganos. Nuestro laboratorio tiene varios hallazgos significativos dentro de nuestro campo de la medicina regenerativa hepática. Mediante el uso de algunas de estas técnicas de miniaturización, hemos identificado pasos clave durante la organogénesis del hígado, incluida la morfogénesis y la migración celular.
Y ese es uno de nuestros hallazgos clave en el campo. Las ventajas de nuestro protocolo dentro de esta publicación permiten varias técnicas diferentes de organoides durante la miniaturización. Así que, esencialmente, ahora podemos estudiar procesos como la morfogénesis ramificada y otros aspectos de la migración en un tejido hepático en miniatura que ninguna otra técnica puede proporcionar.
Las preguntas de investigación que nos haremos en el futuro, debido al trabajo que hemos hecho hasta ahora, se relacionan con cómo se coordina el crecimiento y la migración de las células. Y también preguntaremos acerca de los mecanismos por los cuales podemos ensamblar tejidos en tejidos más grandes que se asemejan al hígado. Para empezar, cultive células de tipo salvaje de hepatoblastoma HepG2 humano en un matraz T75 a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono, cambiando el medio diariamente.
Al alcanzar el 80% de confluencia, enjuague las celdas con PBS. Después de desechar el PBS, incubar las células con cinco mililitros de 0,05% de tripsina EDTA. A continuación, añada cantidades iguales de cDMEM para lavar las células del matraz.
Una vez que las células se desprendan, transfiera la mezcla a un tubo de centrífuga cónico estéril de 15 mililitros y centrifugue la suspensión celular a 300 G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de resuspender las células en cDMEM, cuente las células para determinar la concentración final en células por mililitro. Para etiquetar las células, gírelas a 300 g durante cinco minutos en un tubo cónico de 15 mililitros.
Vuelva a suspender el pellet en un medio de crecimiento libre de suero para lograr una concentración final de uno por 10 a la potencia de seis células por mililitro e incube con cinco microlitros de solución de marcaje de células fluorescentes por mililitro de suspensión celular en rotación. A continuación, centrifugar la suspensión celular a 450 G durante cinco minutos y volver a suspender el pellet celular en cDMEM nuevo. Para la formación de esferoides, mezcle bien la suspensión celular y dispense 100 microlitros de suspensión celular a cada pocillo de la placa de 96 pocillos recubierta de agarosa.
Centrifugar la placa a 340 g durante 10 minutos e incubar a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante cinco a nueve días. Los esferoides hepáticos, independientemente de su tamaño, se compactaron completamente al quinto día, pasando de translúcidos a opacos a medida que se engrosaban. Para empezar, obtenga esferoides hepáticos y mesenquimales en placas de 96 pocillos.
Con una pipeta, recoja los fibroblastos del prepucio humano o los esferoides HFF MRC-5 individualmente en un tubo de centrífuga cónico estéril de 15 mililitros que contenga cDMEM fresco. Incube los esferoides durante cinco minutos en hielo para que se asienten y luego enjuáguelos suavemente con cDMEM tibio. Con una pipeta, transfiera suavemente un solo esferoide HFF MRC-5 a un pocillo que contenga un esferoide de tipo salvaje de hepatoblastoma G2 humano.
Incubar los esferoides con Matrigel reducido en factor de crecimiento helado en una dilución 1:1. Luego, agregue 75 microlitros de cDMEM fresco a cada pocillo e incube a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante dos o tres días. La microscopía de fluorescencia y el análisis de imágenes confirmaron que la formación de ensambles fue exitosa en diferentes matrices y medios, aunque se observaron ligeras variaciones morfológicas.
Un análisis más detallado reveló que una mayor proximidad de los esferoides condujo a tiempos de compactación más rápidos. Para empezar, obtenga esferoides hepáticos de células de tipo salvaje de hepatoblastoma G2 humano. Recoja los esferoides individualmente en una centrífuga cónica estéril de 15 mililitros y coloque el tubo en hielo para que los esferoides se asienten.
A continuación, aspire el medio del tubo con cuidado. En un tubo estéril separado de 15 mililitros, mezcle un mililitro de Matrigel o GFR MG reducido con factor de crecimiento helado y medio de crecimiento de control helado en una dilución de 1:1. Agregue la mezcla en el tubo que contiene los esferoides, asegurando una distribución uniforme de los esferoides.
Con una pipeta de 200 microlitros, recoja 15 microlitros de un solo esferoide en la solución MG y siembrójela lentamente en una placa de Petri de 60 milímetros. Luego, incube las gotas a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante 60 minutos y agregue lentamente cinco mililitros del medio de crecimiento deseado a la placa de Petri. Los esferoides de cáñamo desarrollaron gruesas hebras migratorias que sobresalían hacia los grupos de fibroblastos hacia el noveno día.
Para empezar, recoja fibroblastos de prepucio humano, o células HFF MRC-5, y siembrócelos en un matraz tratado con cultivo de tejidos T75 a una densidad de 5.000 células por centímetro cuadrado. Incubar el matraz a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante 72 horas en 15 mililitros de cDMEM. A continuación, recoja el medio acondicionado mesenquimatoso, o M-CM, en un tubo cónico estéril de 15 mililitros y centrifuérrelo a 290 G durante cinco minutos para eliminar los residuos.
Filtre el sobrenadante con un filtro de 0,2 micrómetros para la esterilización y retenga el filtrado. A continuación, diluya el M-CM con un medio de crecimiento completo en una proporción de dilución de hasta 1:7 para el experimento deseado. Suspenda las células HFF MRC-5 en cDMEM fresco para lograr una concentración final de seis veces 10 elevado a la potencia de cinco células por mililitro y coloque el tubo en hielo.
Mezcle la suspensión celular y el factor de crecimiento helado Matrigel reducido o colágeno de cola de rata en una dilución 1:1. Transfiera 100 microlitros de HFF MRC-5 y solución de Matrigel a un pocillo que contenga un esferoide hepático e incube la placa a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante 30 minutos. Finalmente, agregue 75 microlitros de cDMEM fresco a cada pocillo e incube hasta por 12 días.
La migración colectiva fue efectivamente inducida in vitro utilizando la formación de gotas de esferoides hepáticos con M-MC. Los efectos dependientes de la concentración de M-CM fomentaron la aparición de hebras celulares y la ramificación de los esferoides. Para el día 11, las protuberancias celulares de los esferoides se volvieron más pronunciadas, formando láminas interconectadas.
