Сфера наших исследований находится в этой области органогенеза печени. Вопрос, на который мы пытаемся ответить, заключается в том, как печень становится такой большой и использует ее в подходе обратного проектирования для создания ткани печени из стволовых клеток. Самые последние разработки в области регенеративной медицины печени относятся к области миниатюризации.
Мы используем стволовые клетки для создания миниатюрных тканей, которые воспроизводят реальный орган, и таким образом мы можем изучать формирование органов и биологию органов. Наша лаборатория имеет несколько важных открытий в области регенеративной медицины печени. Используя некоторые из этих методов миниатюризации, мы определили ключевые этапы органогенеза печени, включая морфогенез и миграцию клеток.
И это один из наших ключевых выводов в этой области. Преимущества нашего протокола в этой публикации позволяют использовать несколько различных органоидных методов при миниатюризации. Таким образом, по сути, теперь мы можем изучать такие процессы, как ветвящийся морфогенез и другие аспекты миграции в миниатюрной ткани печени, которые не может обеспечить ни один другой метод.
Исследовательские вопросы, которые мы зададим в будущем, благодаря работе, которую мы уже проделали, связаны с тем, как происходит рост и миграция клеток, как это координируется? А также мы зададимся вопросом о механизмах, с помощью которых мы можем собрать ткани в более крупные ткани, напоминающие печень. Для начала культивируйте клетки гепатобластомы человека дикого типа HepG2 в колбе T75 при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислого газа, ежедневно меняя среду.
По достижении 80% конфлюенции промойте клетки PBS. После отказа от PBS инкубируйте клетки с пятью миллилитрами 0,05% трипсина ЭДТА. Затем добавьте равное количество cDMEM, чтобы смыть клетки с колбы.
После того, как клетки отделятся, переложите смесь в 15-миллилитровую стерильную коническую центрифужную пробирку и центрифугируйте клеточную суспензию при 300 G в течение пяти минут при комнатной температуре. После ресуспендирования клеток в cDMEM подсчитайте клетки, чтобы определить конечную концентрацию в клетках на миллилитр. Чтобы пометить клетки, вращайте их при 300 G в течение пяти минут в 15-миллилитровой конической трубке.
Повторно суспендируйте гранулу в бессывороточной питательной среде до достижения конечной концентрации один умножить на 10 в степени шести клеток на миллилитр и инкубируйте их с пятью микролитрами раствора флуоресцентного мечения клеток на миллилитр клеточной суспензии при вращении. Затем центрифугируйте клеточную суспензию при 450 G в течение пяти минут и повторно суспендируйте клеточную гранулу в свежем cDMEM. Для образования сфероидов хорошо перемешайте клеточную суспензию и нанесите по 100 микролитров клеточной суспензии в каждую лунку 96-луночного планшета, покрытого агарозой.
Центрифугируйте планшет при 340 G в течение 10 минут и инкубируйте при 37 градусах Цельсия с 5% углекислым газом в течение пяти-девяти дней. Сфероиды печени, независимо от размера, полностью уплотнялись к пятому дню, переходя от полупрозрачных к непрозрачным по мере утолщения. Для начала получите печеночные и мезенхимальные сфероиды в 96-луночных планшетах.
С помощью пипетки соберите фибробласты крайней плоти человека или сфероиды HFF MRC-5 по отдельности в 15-миллилитровую стерильную коническую центрифужную пробирку, содержащую свежий cDMEM. Выдержите сфероиды в течение пяти минут на льду, чтобы они остыли, а затем аккуратно промойте их теплым cDMEM. С помощью пипетки аккуратно перенесите один сфероид HFF MRC-5 в лунку, содержащую сфероид гепатобластомы человека G2 дикого типа.
Инкубируйте сфероиды с ледяным фактором роста, уменьшенным Матригелем в соотношении 1:1. Затем добавьте 75 микролитров свежего cDMEM в каждую лунку и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в течение двух-трех дней. Флуоресцентная микроскопия и анализ изображений подтвердили, что формирование ассамблоида было успешным на различных матрицах и средах, хотя были отмечены небольшие морфологические вариации.
Дальнейший анализ показал, что более близкое расположение сфероидов привело к сокращению времени уплотнения. Для начала получите сфероиды печени из клеток гепатобластомы человека G2 дикого типа. Соберите сфероиды по отдельности в стерильную коническую центрифугу объемом 15 миллилитров и поместите пробирку на лед, чтобы сфероиды осели.
Затем осторожно отсадите среду из трубки. В отдельной 15-миллилитровой стерильной пробирке смешайте один миллилитр уменьшенного ледяного фактора роста Matrigel или GFR MG и охлаждающую контрольную питательную среду в соотношении 1:1. Добавьте смесь в пробирку, содержащую сфероиды, обеспечивая равномерное распределение сфероидов.
С помощью пипетки объемом 200 микролитров соберите 15 микролитров одного сфероида в растворе MG и медленно засейте его на 60-миллиметровую чашку Петри. Затем инкубируйте капли при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в течение 60 минут и медленно добавьте пять миллилитров желаемой питательной среды в чашку Петри. К девятому дню у сфероидов Hep развились толстые мигрирующие нити, выступающие к кластерам фибробластов.
Для начала соберите фибробласты крайней плоти человека, или клетки HFF MRC-5, и засейте их в колбу, обработанную культурой тканей T75 с плотностью 5000 клеток на квадратный сантиметр. Инкубируйте колбу при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в течение 72 часов в 15 миллилитрах cDMEM. Затем соберите мезенхимально кондиционированную среду, или М-КМ, в стерильную коническую пробирку объемом 15 миллилитров и центрифугируйте ее при температуре 290 G в течение пяти минут, чтобы удалить мусор.
Отфильтруйте надосадочную жидкость с помощью фильтра 0,2 микрометра для стерилизации и сохраните фильтрат. Затем разбавьте M-CM полной питательной средой в соотношении разведения до 1:7 для желаемого эксперимента. Суспензируйте клетки HFF MRC-5 в свежем cDMEM до достижения конечной концентрации шесть умножить на 10 в степени пяти клеток на миллилитр и поместите трубку на лед.
Смешайте клеточную суспензию и ледяной фактор роста, уменьшенный Матригелем или коллагеном крысиного хвоста в разведении 1:1. Перелейте 100 микролитров HFF MRC-5 и раствора Матригеля в лунку, содержащую сфероид печени, и инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в течение 30 минут. Наконец, добавьте 75 микролитров свежего cDMEM в каждую лунку и выдерживайте до 12 дней.
Коллективная миграция была эффективно индуцирована in vitro с использованием капельного образования сфероидов печени с М-КМ. Концентрационно-зависимые эффекты М-СМ способствовали появлению клеточных нитей и разветвлению от сфероидов. К 11-му дню клеточные выступы из сфероидов стали более выраженными, образуя взаимосвязанные листы.
