היקף המחקר שלנו הוא בתחום זה של אורגנוגנזה בכבד. השאלה שאנו מנסים לענות עליה היא כיצד הכבד הופך להיות כל כך גדול ומשתמש בו בגישה של הנדסה לאחור כדי לבנות רקמת כבד מתאי גזע. ההתפתחויות האחרונות בתחום הרפואה הרגנרטיבית של הכבד הן בתחום המזעור.
אנו משתמשים בתאי גזע כדי ליצור רקמות זעירות שמשכפלות את האיבר עצמו, וכך אנו יכולים לחקור היווצרות איברים וביולוגיה של איברים. למעבדה שלנו יש מספר ממצאים משמעותיים בתחום הרפואה הרגנרטיבית של הכבד. על ידי שימוש בחלק מטכניקות המזעור הללו, זיהינו שלבים מרכזיים במהלך אורגנוגנזה בכבד, כולל מורפוגנזה ונדידת תאים.
וזה אחד הממצאים המרכזיים שלנו בתחום. היתרונות של הפרוטוקול שלנו בפרסום זה מאפשרים מספר טכניקות אורגנואידים שונות במהלך המזעור. אז בעצם אנחנו יכולים עכשיו לחקור תהליכים כמו מורפוגנזה מסועפת והיבטים אחרים של נדידה ברקמת כבד זעירה ששום טכניקה אחרת לא יכולה לספק.
שאלות המחקר שנשאל בעתיד, בגלל העבודה שעשינו עד כה, קשורות לאופן שבו הגדילה והנדידה של התאים מתבצעת, איך זה מתואם? וגם נשאל על מנגנונים שבאמצעותם אנו יכולים להרכיב רקמות לרקמות גדולות יותר הדומות לכבד. כדי להתחיל, טפחו תאים אנושיים מסוג הפטובלסטומה HepG2 בבקבוק T75 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני, והחליפו את המדיום מדי יום.
עם הגעה למפגש של 80%, יש לשטוף את התאים עם PBS. לאחר השלכת ה-PBS, דגרו על התאים עם חמישה מיליליטר של 0.05% של טריפסין EDTA. לאחר מכן הוסף כמויות שוות של cDMEM כדי לשטוף את התאים מהבקבוק.
לאחר ניתוק התאים, העבירו את התערובת לצינור צנטריפוגה חרוטי סטרילי של 15 מיליליטר וצנטריפוגה את תרחיף התאים ב-300 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר השעיית התאים ב-cDMEM, ספור את התאים כדי לקבוע את הריכוז הסופי בתאים למיליליטר. כדי לתייג את התאים, סובב אותם ב -300 גרם למשך חמש דקות בצינור חרוטי של 15 מיליליטר.
השעו מחדש את הגלולה במצע גידול נטול סרום כדי להשיג ריכוז סופי של אחד כפול 10 בחזקת שישה תאים למיליליטר ודגרו אותם עם חמישה מיקרוליטר של תמיסת תיוג תאים פלואורסצנטיים לכל מיליליטר של תרחיף תאים בסיבוב. לאחר מכן, צנטריפוגה את תרחיף התא ב-450 גרם למשך חמש דקות והשעיה מחדש של כדור התא ב-cDMEM טרי. להיווצרות ספרואידים, מערבבים היטב את תרחיף התאים ומחלקים 100 מיקרוליטר של תרחיף תאים לכל באר של צלחת 96 בארות מצופה אגרוז.
צנטריפוגה את הצלחת ב -340 גרם למשך 10 דקות ודגירה ב -37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך חמישה עד תשעה ימים. ספרואידים בכבד, ללא קשר לגודלם, נדחסו במלואם עד היום החמישי, ועברו משקוף לאטום ככל שהם מתעבים. כדי להתחיל, השג ספרואידים כבדיים ומזנכימליים בצלחות של 96 בארות.
בעזרת פיפטה, אסוף פיברובלסטים אנושיים של עורלה או ספרואידים HFF MRC-5 בנפרד לתוך צינור צנטריפוגה חרוטי סטרילי של 15 מיליליטר המכיל cDMEM טרי. דגרו את הספרואידים במשך חמש דקות על קרח כדי לתת להם להתייצב, ולאחר מכן שטפו אותם בעדינות עם cDMEM חם. בעזרת פיפטה, העבירו בעדינות ספרואיד HFF MRC-5 יחיד לבאר המכילה ספרואיד אנושי מסוג הפטובלסטומה G2 מסוג בר.
דגירה על הספרואידים עם גורם גדילה קר כקרח מופחת מטריג'ל בדילול של 1:1. לאחר מכן, הוסיפו 75 מיקרוליטר cDMEM טרי לכל באר ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך יומיים-שלושה. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וניתוח תמונה אישרו כי היווצרות האסמבלואידים הייתה מוצלחת על פני מטריצות ומדיות שונות, אם כי נרשמו שינויים מורפולוגיים קלים.
ניתוח נוסף גילה כי קרבה קרובה יותר של ספרואידים הובילה לזמני דחיסה מהירים יותר. כדי להתחיל, השג ספרואידים בכבד מתאי הפטובלסטומה G2 אנושיים מסוג בר. אוספים את הספרואידים בנפרד לצנטריפוגה חרוטית סטרילית של 15 מיליליטר, ומניחים את הצינור על קרח כדי לאפשר לספרואידים להתייצב.
לאחר מכן, שאפו את המדיום מהצינור בזהירות. בצינור סטרילי נפרד של 15 מיליליטר, מערבבים מיליליטר אחד של גורם גדילה קר כקרח מופחת מטריג'ל או GFR MG ומדיום גידול בקרת קרח בדילול של 1:1. הוסף את התערובת לתוך הצינור המכיל את הספרואידים, והבטיח פיזור ספרואיד אחיד.
בעזרת פיפטה של 200 מיקרוליטר, אספו 15 מיקרוליטר של כדור בודד בתמיסת MG וזרעו אותו לאט לאט על צלחת פטרי בגודל 60 מילימטר. לאחר מכן, דגרו את הטיפות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך 60 דקות והוסיפו לאט לאט חמישה מיליליטר ממצע הגידול הרצוי לצלחת הפטרי. ספרואידים של הפ פיתחו גדילים נודדים עבים הבולטים לעבר אשכולות הפיברובלסטים ביום התשיעי.
כדי להתחיל, קצרו פיברובלסטים אנושיים של עורלה, או תאי HFF MRC-5, וזרעו אותם לתוך בקבוק שטופל בתרבית רקמה T75 בצפיפות של 5,000 תאים לסנטימטר מרובע. דגרו את הבקבוק בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך 72 שעות ב-15 מיליליטר cDMEM. לאחר מכן, אספו את המדיה המזנכימלית, או M-CM, בצינור חרוטי סטרילי של 15 מיליליטר וצנטריפוגה אותה ב-290 גרם למשך חמש דקות כדי להסיר פסולת.
מסננים את הסופרנטנט עם מסנן של 0.2 מיקרומטר לעיקור ושומרים על הסינון. לאחר מכן, יש לדלל את ה-M-CM עם מדיום גידול מלא ביחס דילול של עד 1:7 לניסוי הרצוי. השעו את תאי ה-HFF MRC-5 ב-cDMEM טרי כדי להשיג ריכוז סופי של שש פעמים 10 בחזקת חמישה תאים למיליליטר והניחו את הצינור על קרח.
ערבבו את תרחיף התאים וגורם הגדילה הקר כקרח, הפחיתו את המטריג'ל או קולגן זנב העכברוש בדילול של 1:1. העבירו 100 מיקרוליטר של תמיסת HFF MRC-5 ומטריג'ל לבאר המכילה ספרואיד כבד ודגרו על הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך 30 דקות. לבסוף, הוסף 75 מיקרוליטר cDMEM טרי לכל באר ודגר עד 12 יום.
הגירה קולקטיבית הושרה ביעילות במבחנה באמצעות היווצרות טיפות של ספרואידים בכבד עם M-CM. ההשפעות תלויות הריכוז של M-CM עודדו את הופעתם של גדילי תאים והסתעפות מהספרואידים. ביום ה-11, הבליטות התאיות מהספרואידים הפכו בולטות יותר, ויצרו יריעות מחוברות זו לזו.
