La portée de nos recherches se situe dans ce domaine de l’organogenèse hépatique. La question à laquelle nous essayons de répondre est de savoir comment le foie devient si gros et l’utilise dans une approche de rétro-ingénierie pour construire du tissu hépatique à partir de cellules souches. Les développements les plus récents dans notre domaine de la médecine régénérative du foie se situent dans le domaine de la miniaturisation.
Nous utilisons des cellules souches pour fabriquer des tissus miniatures qui reproduisent l’organe réel, et de cette façon, nous pouvons étudier la formation et la biologie des organes. Notre laboratoire a fait plusieurs découvertes importantes dans notre domaine de la médecine régénérative du foie. En utilisant certaines de ces techniques de miniaturisation, nous avons identifié des étapes clés de l’organogenèse hépatique, notamment la morphogenèse et la migration cellulaire.
C’est donc l’une de nos principales conclusions sur le terrain. Les avantages de notre protocole au sein de cette publication permettent plusieurs techniques organoïdes différentes lors de la miniaturisation. Donc, essentiellement, nous pouvons maintenant étudier des processus tels que la morphogenèse ramifiée et d’autres aspects de la migration dans un tissu hépatique miniature qu’aucune autre technique ne peut fournir.
Les questions de recherche que nous poserons à l’avenir, en raison du travail que nous avons accompli jusqu’à présent, portent sur la façon dont la croissance et la migration des cellules, comment cela est-il coordonné ? Et nous poserons également des questions sur les mécanismes par lesquels nous pouvons assembler des tissus en tissus plus grands qui ressemblent au foie. Pour commencer, cultivez des cellules sauvages d’hépatoblastome humain HepG2 dans un flacon T75 à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone, en changeant le milieu tous les jours.
Lorsque vous atteignez 80 % de confluence, rincez les cellules avec du PBS. Après avoir jeté le PBS, incubez les cellules avec cinq millilitres de 0,05 % de trypsine EDTA. Ajoutez ensuite des quantités égales de cDMEM pour laver les cellules du flacon.
Une fois les cellules détachées, transférez le mélange dans un tube à centrifuger conique stérile de 15 millilitres et centrifugez la suspension cellulaire à 300 G pendant cinq minutes à température ambiante. Après avoir remis les cellules en suspension dans le cDMEM, comptez les cellules pour déterminer la concentration finale en cellules par millilitre. Pour marquer les cellules, faites-les tourner à 300 G pendant cinq minutes dans un tube conique de 15 millilitres.
Remettez la pastille en suspension dans un milieu de croissance sans sérum pour obtenir une concentration finale d’une fois 10 à la puissance six cellules par millilitre et incubez-les avec cinq microlitres de solution de marquage cellulaire fluorescent par millilitre de suspension cellulaire en rotation. Ensuite, centrifugez la suspension cellulaire à 450 G pendant cinq minutes et mettez à nouveau en suspension la pastille cellulaire dans du cDMEM frais. Pour la formation de sphéroïdes, mélangez bien la suspension cellulaire et distribuez 100 microlitres de suspension cellulaire dans chaque puits de la plaque à 96 puits recouverte d’agarose.
Centrifugez la plaque à 340 G pendant 10 minutes et incubez à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant cinq à neuf jours. Les sphéroïdes hépatiques, quelle que soit leur taille, se sont complètement compactés au cinquième jour, passant de translucides à opaques à mesure qu’ils s’épaississaient. Pour commencer, obtenez des sphéroïdes hépatiques et mésenchymateux dans des plaques à 96 puits.
À l’aide d’une pipette, prélever individuellement les fibroblastes du prépuce humain ou les sphéroïdes HFF MRC-5 dans un tube à centrifuger conique stérile de 15 millilitres contenant du cDMEM frais. Incuber les sphéroïdes pendant cinq minutes sur de la glace pour les laisser se déposer, puis rincez-les doucement avec du cDMEM chaud. À l’aide d’une pipette, transférez doucement un seul sphéroïde HFF MRC-5 dans un puits contenant un sphéroïde de type sauvage de l’hépatoblastome humain G2.
Incuber les sphéroïdes avec du Matrigel à facteur de croissance réduit en facteur de croissance glacé dans une dilution de 1:1. Ensuite, ajoutez 75 microlitres de cDMEM frais dans chaque puits et incubez à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant deux à trois jours. La microscopie à fluorescence et l’analyse d’images ont confirmé que la formation assembloïde était réussie dans différentes matrices et milieux, bien que de légères variations morphologiques aient été notées.
Une analyse plus approfondie a révélé qu’une plus grande proximité des sphéroïdes entraînait des temps de compactage plus rapides. Pour commencer, obtenez des sphéroïdes hépatiques à partir de cellules sauvages de type sauvage de l’hépatoblastome humain G2. Recueillez les sphéroïdes individuellement dans une centrifugeuse conique stérile de 15 millilitres et placez le tube sur de la glace pour laisser les sphéroïdes se déposer.
Ensuite, aspirez soigneusement le fluide du tube. Dans un tube stérile séparé de 15 millilitres, mélanger un millilitre de Matrigel ou de GFR MG à facteur de croissance glacé réduit et un milieu de croissance témoin glacé à une dilution de 1:1. Ajoutez le mélange dans le tube contenant les sphéroïdes, en assurant une distribution uniforme des sphéroïdes.
À l’aide d’une pipette de 200 microlitres, prélevez 15 microlitres d’un seul sphéroïde dans la solution MG et ensemencez-le lentement dans une boîte de Pétri de 60 millimètres. Ensuite, incubez les gouttelettes à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 60 minutes et ajoutez lentement cinq millilitres du milieu de croissance souhaité dans la boîte de Pétri. Les sphéroïdes de l’hépatite ont développé d’épais brins migrateurs dépassant vers les amas de fibroblastes dès le neuvième jour.
Pour commencer, récoltez des fibroblastes de prépuce humain, ou cellules HFF MRC-5, et ensemencez-les dans un flacon traité de culture tissulaire T75 à une densité de 5 000 cellules par centimètre carré. Incuber le ballon à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 72 heures dans 15 millilitres de cDMEM. Ensuite, collectez le milieu conditionné au mésenchyme, ou M-CM, dans un tube conique stérile de 15 millilitres et centrifugez-le à 290 G pendant cinq minutes pour éliminer les débris.
Filtrez le surnageant à l’aide d’un filtre de 0,2 micromètre pour la stérilisation et conservez le filtrat. Ensuite, diluez le M-CM avec un milieu de croissance complet à un rapport de dilution allant jusqu’à 1:7 pour l’expérience souhaitée. Suspendez les cellules HFF MRC-5 dans du cDMEM frais pour atteindre une concentration finale de six fois 10 à la puissance cinq cellules par millilitre et placez le tube sur de la glace.
Mélangez la suspension cellulaire et le facteur de croissance glacé réduit en Matrigel ou en collagène de queue de rat en dilution 1:1. Transférez 100 microlitres de HFF MRC-5 et de solution Matrigel dans un puits contenant un sphéroïde hépatique et incubez la plaque à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 30 minutes. Enfin, ajoutez 75 microlitres de cDMEM frais dans chaque puits et incubez jusqu’à 12 jours.
La migration collective a été induite in vitro en utilisant la formation de gouttelettes de sphéroïdes hépatiques avec M-CM. Les effets dépendants de la concentration de M-CM ont favorisé l’émergence de brins cellulaires et la ramification des sphéroïdes. Au 11e jour, les protubérances cellulaires des sphéroïdes sont devenues plus prononcées, formant des feuilles interconnectées.
