O escopo de nossa pesquisa está nesta área da organogênese hepática. A pergunta que estamos tentando responder é como o fígado fica tão grande e o usa em uma abordagem de engenharia reversa para construir tecido hepático a partir de células-tronco. Os desenvolvimentos mais recentes em nosso campo da medicina regenerativa do fígado estão na área de miniaturização.
Estamos usando células-tronco para fazer tecidos em miniatura que replicam o órgão real e, dessa forma, podemos estudar a formação e a biologia dos órgãos. Nosso laboratório tem várias descobertas significativas em nosso campo da medicina regenerativa do fígado. Usando algumas dessas técnicas de miniaturização, identificamos as principais etapas durante a organogênese hepática, incluindo morfogênese e migração celular.
E essa é uma das nossas principais descobertas no campo. As vantagens do nosso protocolo nesta publicação permitem várias técnicas organoides diferentes durante a miniaturização. Então, essencialmente, agora podemos estudar processos como ramificação, morfogênese e outros aspectos da migração em um tecido hepático em miniatura que nenhuma outra técnica pode fornecer.
As perguntas de pesquisa que faremos no futuro, por causa do trabalho que fizemos até agora, estão relacionadas a como o crescimento e a migração das células, como isso é coordenado? E também perguntaremos sobre os mecanismos pelos quais podemos montar tecidos em tecidos maiores que se assemelham ao fígado. Para começar, cultive células do tipo selvagem HepG2 do hepatoblastoma humano em um frasco T75 a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono, trocando o meio diariamente.
Ao atingir 80% de confluência, enxágue as células com PBS. Após descartar o PBS, incube as células com cinco mililitros de 0,05% de tripsina EDTA. Em seguida, adicione quantidades iguais de cDMEM para lavar as células do frasco.
Assim que as células se soltarem, transfira a mistura para um tubo de centrífuga cônico estéril de 15 mililitros e centrifugue a suspensão da célula a 300 G por cinco minutos em temperatura ambiente. Depois de ressuspender as células em cDMEM, conte as células para determinar a concentração final em células por mililitro. Para rotular as células, gire-as a 300 G por cinco minutos em um tubo cônico de 15 mililitros.
Ressuspenda o pellet em um meio de crescimento sem soro para atingir uma concentração final de uma vez 10 elevado a seis células por mililitro e incube-os com cinco microlitros de solução de marcação de células fluorescentes por mililitro de suspensão celular em rotação. Em seguida, centrifugar a suspensão celular a 450 G durante cinco minutos e ressuspender o sedimento celular em cDMEM fresco. Para a formação de esferoides, misture bem a suspensão celular e dispense 100 microlitros de suspensão celular para cada poço da placa de 96 poços revestida com agarose.
Centrifugue a placa a 340 G por 10 minutos e incube a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por cinco a nove dias. Os esferoides hepáticos, independentemente do tamanho, compactaram-se totalmente no quinto dia, passando de translúcidos para opacos à medida que engrossavam. Para começar, obtenha esferóides hepáticos e mesenquimais em placas de 96 poços.
Usando uma pipeta, colete fibroblastos de prepúcio humano ou esferoides HFF MRC-5 individualmente em um tubo de centrífuga cônico estéril de 15 mililitros contendo cDMEM fresco. Incube os esferoides por cinco minutos no gelo para deixá-los assentar e, em seguida, enxágue-os suavemente com cDMEM quente. Usando uma pipeta, transfira suavemente um único esferóide HFF MRC-5 para um poço contendo um esferóide do tipo selvagem G2 do hepatoblastoma humano.
Incubar os esferóides com Matrigel reduzido por fator de crescimento gelado em uma diluição de 1:1. Em seguida, adicione 75 microlitros de cDMEM fresco a cada poço e incube a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por dois a três dias. A microscopia de fluorescência e a análise de imagem confirmaram que a formação do assembloide foi bem-sucedida em diferentes matrizes e meios, embora pequenas variações morfológicas tenham sido observadas.
Uma análise mais aprofundada revelou que a proximidade dos esferoides levou a tempos de compactação mais rápidos. Para começar, obtenha esferóides hepáticos de células do tipo selvagem G2 do hepatoblastoma humano. Colete os esferóides individualmente em uma centrífuga cônica estéril de 15 mililitros e coloque o tubo no gelo para permitir que os esferóides assentem.
Em seguida, aspire o meio do tubo com cuidado. Em um tubo estéril separado de 15 mililitros, misture um mililitro de Matrigel ou GFR MG reduzido com fator de crescimento gelado e meio de crescimento de controle gelado em uma diluição de 1:1. Adicione a mistura ao tubo que contém os esferoides, garantindo uma distribuição uniforme dos esferoides.
Usando uma pipeta de 200 microlitros, colete 15 microlitros de um único esferóide na solução de MG e semeie-o lentamente em uma placa de Petri de 60 milímetros. Em seguida, incube as gotículas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 60 minutos e adicione lentamente cinco mililitros do meio de crescimento desejado à placa de Petri. Os esferóides de hepatite desenvolveram filamentos migratórios espessos projetando-se em direção aos aglomerados de fibroblastos no nono dia.
Para começar, colha fibroblastos do prepúcio humano, ou células HFF MRC-5, e semeie-os em um frasco tratado com cultura de tecidos T75 a uma densidade de 5.000 células por centímetro quadrado. Incubar o frasco a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 72 horas em 15 mililitros de cDMEM. Em seguida, colete o meio condicionado mesenquimal, ou M-CM, em um tubo cônico estéril de 15 mililitros e centrifugue-o a 290 G por cinco minutos para remover os detritos.
Filtrar o sobrenadante com um filtro de 0,2 micrómetros para esterilização e reter o filtrado. Em seguida, diluir o M-CM com meio de crescimento completo na proporção de diluição de até 1:7 para o experimento desejado. Suspenda as células HFF MRC-5 em cDMEM fresco para atingir uma concentração final de seis vezes 10 elevado a cinco células por mililitro e coloque o tubo no gelo.
Misture a suspensão celular e o fator de crescimento gelado reduzido Matrigel ou colágeno de cauda de rato em diluição 1:1. Transfira 100 microlitros de HFF MRC-5 e solução de Matrigel para um poço contendo um esferóide hepático e incube a placa a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 30 minutos. Por fim, adicione 75 microlitros de cDMEM fresco a cada poço e incube por até 12 dias.
A migração coletiva foi efetivamente induzida in vitro usando a formação de gotículas de esferoides hepáticos com M-CM. Os efeitos dependentes da concentração do M-CM promoveram o surgimento de fitas celulares e ramificações dos esferoides. No dia 11, as saliências celulares dos esferoides tornaram-se mais pronunciadas, formando folhas interconectadas.
