Araştırmamızın kapsamı karaciğer organogenezinin bu alanındadır. Cevaplamaya çalıştığımız soru, karaciğerin nasıl bu kadar büyüdüğü ve kök hücrelerden karaciğer dokusu oluşturmak için tersine mühendislik yaklaşımında nasıl kullanıldığıdır. Karaciğer rejeneratif tıp alanımızdaki en son gelişmeler minyatürleştirme alanındadır.
Gerçek organı kopyalayan minyatür dokular yapmak için kök hücreleri kullanıyoruz ve bu şekilde organ oluşumunu ve organ biyolojisini inceleyebiliriz. Laboratuvarımız, karaciğer rejeneratif tıp alanımız içinde birkaç önemli bulguya sahiptir. Bu minyatürleştirme tekniklerinden bazılarını kullanarak, morfogenez ve hücre göçü dahil olmak üzere karaciğer organogenezi sırasında önemli adımları belirledik.
Ve bu, alandaki en önemli bulgularımızdan biri. Bu yayındaki protokolümüzün avantajları, minyatürleştirme sırasında birkaç farklı organoid tekniği mümkün kılmaktadır. Yani esasen artık minyatür bir karaciğer dokusunda dallanma, morfogenez ve göçün diğer yönleri gibi süreçleri inceleyebiliriz ki bu başka hiçbir teknik mümkün değildir.
Gelecekte soracağımız araştırma soruları, şimdiye kadar yaptığımız çalışmalar nedeniyle, hücrelerin büyümesi ve göçünün nasıl gerçekleştiği, bunun nasıl koordine edildiği ile ilgilidir. Ayrıca, dokuları karaciğere benzeyen daha büyük dokular halinde bir araya getirebileceğimiz mekanizmalar hakkında da sorular soracağız. Başlamak için, insan hepatoblastomu HepG2 vahşi tip hücreleri, 37 santigrat derecede bir T75 şişesinde% 5 karbondioksit ile yetiştirin ve ortamı günlük olarak değiştirin.
% 80 birleşmeye ulaştıktan sonra, hücreleri PBS ile durulayın. PBS'yi attıktan sonra, hücreleri beş mililitre% 0.05 tripsin EDTA ile inkübe edin. Daha sonra hücreleri şişeden yıkamak için eşit miktarda cDMEM ekleyin.
Hücreler ayrıldıktan sonra, karışımı 15 mililitrelik steril bir konik santrifüj tüpüne aktarın ve hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında beş dakika boyunca 300 G'de santrifüjleyin. Hücreleri cDMEM'de yeniden süspanse ettikten sonra, mililitre başına hücrelerdeki nihai konsantrasyonu belirlemek için hücreleri sayın. Hücreleri etiketlemek için, 15 mililitrelik konik bir tüpte beş dakika boyunca 300 G'de döndürün.
Mililitrede altı hücrenin gücüne bir kez 10'luk bir nihai konsantrasyon elde etmek için peleti serumsuz bir büyüme ortamında yeniden süspanse edin ve bunları rotasyonda mililitre hücre süspansiyonu başına beş mikrolitre floresan hücre etiketleme çözeltisi ile inkübe edin. Daha sonra, hücre süspansiyonunu 450 G'de beş dakika santrifüjleyin ve hücre peletini taze cDMEM'de yeniden süspanse edin. Küresel oluşum için, hücre süspansiyonunu iyice karıştırın ve agaroz kaplı 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 100 mikrolitre hücre süspansiyonu dağıtın.
Plakayı 340 G'de 10 dakika santrifüjleyin ve beş ila dokuz gün boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin. Hepatik sferoidler, boyutlarından bağımsız olarak, beşinci günde tamamen sıkıştırılır ve kalınlaştıkça yarı saydamdan opak hale geçer. Başlamak için, 96 oyuklu plakalarda hepatik ve mezenkimal sferoidler elde edin.
Bir pipet kullanarak, insan sünnet derisi fibroblastlarını veya HFF MRC-5 sferoidlerini ayrı ayrı taze cDMEM içeren 15 mililitrelik steril konik santrifüj tüpüne toplayın. Yerleşmelerini sağlamak için sferoidleri buz üzerinde beş dakika kuluçkaya yatırın ve ardından ılık cDMEM ile nazikçe durulayın. Bir pipet kullanarak, tek bir HFF MRC-5 sferoidini, bir insan hepatoblastomu G2 vahşi tip sferoid içeren bir kuyuya nazikçe aktarın.
Sferoidleri 1: 1 seyreltmede buz gibi soğuk büyüme faktörü azaltılmış Matrigel ile inkübe edin. Daha sonra, her bir oyuğa 75 mikrolitre taze cDMEM ekleyin ve iki ila üç gün boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin. Floresan mikroskobu ve görüntü analizi, hafif morfolojik farklılıklar kaydedilse de, assemboid oluşumunun farklı matrisler ve ortamlarda başarılı olduğunu doğruladı.
Daha fazla analiz, sferoidlerin daha yakın olmasının daha hızlı sıkıştırma sürelerine yol açtığını ortaya çıkardı. Başlamak için, insan hepatoblastom G2 vahşi tip hücrelerinden hepatik sferoidler elde edin. Sferoidleri ayrı ayrı 15 mililitrelik steril bir konik santrifüjde toplayın ve sferoidlerin yerleşmesine izin vermek için tüpü buzun üzerine yerleştirin.
Ardından, ortamı tüpten dikkatlice aspire edin. Ayrı bir 15 mililitrelik steril tüpte, bir mililitre buz gibi soğuk büyüme faktörü azaltılmış Matrigel veya GFR MG ve buz gibi soğuk kontrol büyüme ortamını 1: 1 seyreltmede karıştırın. Karışımı, sferoidleri içeren tüpe ekleyin ve eşit küresel dağılım sağlayın.
200 mikrolitrelik bir pipet kullanarak, MG çözeltisinde 15 mikrolitre tek bir sferoid toplayın ve yavaşça 60 milimetrelik bir Petri kabına tohumlayın. Daha sonra, damlacıkları 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile 60 dakika inkübe edin ve istenen büyüme ortamından beş mililitreyi Petri kabına yavaşça ekleyin. Hep sferoidler, dokuzuncu günde fibroblast kümelerine doğru çıkıntı yapan kalın göç eden iplikler geliştirdi.
Başlamak için, insan sünnet derisi fibroblastlarını veya HFF MRC-5 hücrelerini hasat edin ve bunları santimetre kare başına 5.000 hücre yoğunluğunda T75 doku kültürü ile muamele edilmiş bir şişeye tohumlayın. Şişeyi 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile 72 mililitre cDMEM içinde 72 saat inkübe edin. Daha sonra, mezenkimal şartlandırılmış ortamı veya M-CM'yi 15 mililitrelik steril bir konik tüpte toplayın ve kalıntıları gidermek için beş dakika boyunca 290 G'de santrifüjleyin.
Süpernatanı sterilizasyon için 0.2 mikrometrelik bir filtre ile filtreleyin ve süzüntüyü saklayın. Ardından, istenen deney için M-CM'yi 1: 7 seyreltme oranına kadar tam büyüme ortamı ile seyreltin. HFF MRC-5 hücrelerini, mililitrede beş hücrenin gücüne altı kez 10'luk bir nihai konsantrasyon elde etmek için taze cDMEM'de askıya alın ve tüpü buzun üzerine yerleştirin.
Hücre süspansiyonunu ve buz gibi soğuk büyüme faktörü azaltılmış Matrigel veya sıçan kuyruğu kollajenini 1: 1 seyreltmede karıştırın. 100 mikrolitre HFF MRC-5 ve Matrigel çözeltisini hepatik sferoid içeren bir kuyucuğa aktarın ve plakayı 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile 30 dakika inkübe edin. Son olarak, her bir oyuğa 75 mikrolitre taze cDMEM ekleyin ve 12 güne kadar inkübe edin.
Toplu göç, M-CM ile hepatik sferoidlerin damlacık oluşumu kullanılarak in vitro olarak etkili bir şekilde indüklendi. M-CM'nin konsantrasyona bağlı etkileri, hücresel ipliklerin ortaya çıkmasını ve sferoidlerden dallanmayı teşvik etti. 11. günde, sferoidlerden gelen hücresel çıkıntılar daha belirgin hale geldi ve birbirine bağlı tabakalar oluşturdu.
