In Vitro Cultivation Techniques for Modeling Liver Organogenesis, Building Assembloids, and Designing Synthetic Tissues using Human Cell Lines

我们的研究范围在肝脏器官发生的这一领域。我们试图回答的问题是，肝脏是如何变得如此大，并以逆向工程方法使用它来从干细胞构建肝组织的。我们肝脏再生医学领域的最新发展是在小型化领域。

我们正在使用干细胞制造复制实际器官的微型组织，这样，我们就可以研究器官形成和器官生物学。我们的实验室在肝脏再生医学领域有几项重要发现。通过使用其中一些微型化技术，我们已经确定了肝脏器官发生过程中的关键步骤，包括形态发生和细胞迁移。

这就是我们在该领域的主要发现之一。我们在本出版物中协议的优势在小型化过程中实现了几种不同的类器官技术。因此，从本质上讲，我们现在可以研究微型肝组织中分支形态发生和迁移的其他方面等过程，这是其他技术无法提供的。

由于我们迄今为止所做的工作，我们将来要提出的研究问题与细胞的生长和迁移如何相关，这是如何协调的？我们还将询问我们可以将组织组装成类似于肝脏的更大组织的机制。首先，在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的 T75 培养瓶中培养人肝母细胞瘤 HepG2 野生型细胞，每天更换培养基。

达到 80% 汇合度后，用 PBS 冲洗细胞。丢弃 PBS 后，将细胞与 5 毫升 0.05% 胰蛋白酶 EDTA 一起孵育。然后加入等量的 cDMEM 以洗掉培养瓶上的细胞。

细胞分离后，将混合物转移至 15 mL 无菌锥形离心管中，并在室温下以 300 G 离心细胞悬液 5 分钟。将细胞重悬于 cDMEM 中后，对细胞进行计数以确定每毫升细胞的最终浓度。要标记细胞，请在 15 mL 锥形管中以 300 G 离心 5 分钟。

将沉淀重悬于无血清生长培养基中，以达到 1 乘以 10 的 1 次方/毫升的最终浓度，并与每毫升细胞悬液 5 微升荧光细胞标记溶液旋转孵育。接下来，将细胞悬液以 450 G 离心 5 分钟，然后将细胞沉淀重悬于新鲜的 cDMEM 中。对于球状体形成，将细胞悬液充分混合，并将 100 μL 细胞悬液分配到琼脂糖包被的 96 孔板的每个孔中。

将板以 340 G 离心 10 分钟，并在 37 摄氏度下与 5% 二氧化碳一起孵育 5 到 9 天。肝球体，无论大小，都在第 5 天完全压实，随着增厚从半透明过渡到不透明。首先，在 96 孔板中获得肝脏和间充质球体。

使用移液器，将人包皮成纤维细胞或 HFF MRC-5 球体单独收集到含有新鲜 cDMEM 的 15 毫升无菌锥形离心管中。将球状体在冰上孵育 5 分钟，让其沉淀，然后用温热的 cDMEM 轻轻冲洗。使用移液器，将单个 HFF MRC-5 球体轻轻转移到含有人肝母细胞瘤 G2 野生型球体的孔中。

将球状体与冰冷的生长因子还原的 Matrigel 以 1：1 稀释孵育。然后，向每个孔中加入 75 微升新鲜 cDMEM，并在 37 摄氏度下与 5% 二氧化碳孵育 2 至 3 天。荧光显微镜和图像分析证实，组装体的形成在不同的基质和介质中是成功的，尽管注意到轻微的形态变化。

进一步的分析表明，球体更接近导致更快的压缩时间。首先，从人肝母细胞瘤 G2 野生型细胞中获得肝球体。将球体单独收集到 15 毫升无菌锥形离心机中，并将试管放在冰上让球体沉降。

然后，小心地从试管中吸出培养基。在单独的 15 mL 无菌试管中，将 1 mL 冰冷生长因子还原的 Matrigel 或 GFR MG 与冰冷的对照生长培养基以 1：1 的稀释度混合。将混合物添加到含有球体的试管中，确保球体分布均匀。

使用 200 微升移液器，在 MG 溶液中收集 15 微升单个球体，并将其缓慢接种到 60 毫米培养皿上。然后，将液滴在 37 摄氏度下与 5% 二氧化碳孵育 60 分钟，并将 5 毫升所需的生长培养基缓慢加入培养皿中。到第 9 天，Hep 球体发育出向成纤维细胞簇突出的粗迁移链。

首先，收获人包皮成纤维细胞或 HFF MRC-5 细胞，并以每平方厘米 5， 000 个细胞的密度将它们接种到 T75 组织培养处理的烧瓶中。将培养瓶在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳中在 15 ml cDMEM 中孵育 72 小时。接下来，将间充质条件培养基 （M-CM） 收集在 15 毫升无菌锥形管中，并以 290 G 离心 5 分钟以去除碎片。

用 0.2 微米过滤器过滤上清液进行灭菌并保留滤液。然后，用完全生长培养基以高达 1：7 的稀释比例稀释 M-CM，以进行所需的实验。将 HFF MRC-5 细胞悬浮在新鲜的 cDMEM 中，以达到 6 倍 10 的最终浓度，达到每毫升 5 个细胞的幂，然后将试管置于冰上。

将细胞悬液和冰冷的生长因子还原的基质胶或大鼠尾胶胶以 1：1 稀释混合。将 100 μL HFF MRC-5 和 Matrigel 溶液转移到含有肝球体的孔中，并在 37 摄氏度下用 5% 二氧化碳孵育板 30 分钟。最后，向每个孔中加入 75 μL 新鲜 cDMEM，并孵育长达 12 天。

使用 M-CM 形成肝球状体的液滴在体外有效诱导集体迁移。M-CM 的浓度依赖性效应促进了细胞链的出现并从球体分支。到第 11 天，球状体的细胞突起变得更加明显，形成相互连接的片状。