يركز بحثي على فهم إعادة تشكيل مجرى الهواء البشري. يعمل مجرى الهواء البشري كحاجز ضد السموم البيئية ، بما في ذلك الفيروسات وتلوث الهواء ودخان التبغ. يمكن أن تصيب هذه السموم مجرى الهواء ، مما يجعلها تتغير أو تعيد تشكيلها ، مما يجعل التنفس صعبا.
لا يشمل النظام النموذجي الخلايا الظهارية التي تشكل الحاجز فحسب ، بل يشمل أيضا الخلايا الأخرى المهمة في توازن مجرى الهواء ، بما في ذلك خلايا الأوعية الدموية والخلايا المناعية التي تسمى الضامة. تشمل التحديات التجريبية الحالية نمذجة الرئة البشرية في نظام نموذج في المختبر. من الصعب الحصول على عينات الرئة الأولية كما يصعب استزراعها.
وبالتالي ، فإن استخدام خلايا مجرى الهواء الرئوي المشتقة من الخلايا الجذعية المستثمرة في الخلايا البطانية والضامة هو الخطوة التالية للتغلب على هذه التحديات. للبدء ، قم بتغطية الجانب القمي لإدخالات ثقافة خلايا البوليستر المسامية بحجم 3 ميكرومتر ب 4 ملليغرام لكل مليلتر من محلول المصفوفة خارج الخلية ، أو ECM. ماصة من حل ECM المتبقي.
ثم ضع الطبق في الحاضنة لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. باستخدام ملاقط نظيفة ، انقل إدخالات ثقافة الخلايا بشكل معقم من الصفيحة المكونة من 12 بئرا إلى طبق بتري كبير. بعد ذلك ، قم بتغطية الجانب القاعدي الجانبي من إدخالات ثقافة الخلية بمحلول ECM.
بعد سحب محلول ECM المتبقي ، ضع طبق بتري في حاضنة 37 درجة مئوية حتى يجف طوال الليل. اغسل قارورة T75 التي تحتوي على الخلايا البطانية المشتقة من iPSC باستخدام PBS. بعد شفط المحلول ، أضف 5 ملليلتر من البروتياز الشبيه بالتربسين إلى القارورة واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 8 دقائق.
اضغط على القارورة للتأكد من انفصال الخلايا البطانية. ثم انقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا. أضف 5 ملليلتر من وسائط التوقف لوقف التفكك.
بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للخلايا عند 300 جم لمدة 5 دقائق. بمجرد شفط المادة الطافية ، أعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مليلتر من وسائط الثقافة البطانية التي تحتوي على 10 ميكرومولار من مثبط الصخور. بعد اقتباس 150،000 خلية ، أعد تعليقها في 100 ميكرولتر من الوسائط والماصة على إدراج ثقافة الخلية المقلوبة مع توجيه الجانب القاعدي لأعلى.
انقل الخلايا بعناية إلى الحاضنة واتركها دون إزعاج لمدة 3 ساعات. بعد ذلك ، في طبق مكون من 12 بئرا ، أضف 1 مليلتر من وسائط الثقافة البطانية إلى كل بئر. قم بإزالة طبق بتري مع الخلايا البطانية من الحاضنة.
باستخدام ملاقط نظيفة ، انقل إدخالات ثقافة الخلايا بعناية إلى اللوحة باستخدام وسائط الثقافة البطانية. بعد التحقق بصريا من أن الخلايا البطانية قد تلتصقت ، ضع اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية طوال الليل. بعد عزل العضيات عن بوليمر ECM والتربسين لمدة 15-20 دقيقة ، أضف 3 ملليلتر من وسائط التوقف لإيقاف تفاعل البروتياز.
أعد تعليق المحلول باستخدام ماصة P1000 وجهاز طرد مركزي عند 400 جم لمدة 5 دقائق. بعد ذلك ، قم بشفط المادة الطافية من عضيات مجرى الهواء وأعد تعليق العضيات في 1 مليلتر من وسائط تمدد مجرى الهواء مع 10 ميكرومولار من مثبط ROCK. خذ عينة سعة 10 ميكرولتر لعدد خلايا مقياس كثافة الدم وضع الخلايا المتبقية على الجليد أثناء العد.
البذرة التالية 300, 000 خلايا مجرى الهواء المشتقة من iPSC في 500 ميكرولتر من وسائط توسيع مجرى الهواء لكل 12 إدراج مليمتر لثقافة الخلية. قم بإزالة اللوحة بإدخالات زراعة الخلايا التي تحتوي على خلايا بطانية من حاضنة 37 درجة مئوية. أعد تعليق خلايا مجرى الهواء iPSC والماصة 500 ميكرولتر تحتوي على 300,000 الخلايا في الغرفة القمية لكل إدراج ثقافة خلية.
ضع اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة ، مع الحفاظ على الخلايا القمية في ظروف السائل والسائل. بعد الحضانة ، قم بإزالة الوسائط من الجانب القمي لإدخال ثقافة الخلية. قم بتغيير الوسائط القاعدية الجانبية إلى مزيج 1: 1 من وسائط تمايز مجرى الهواء ووسائط الثقافة البطانية.
أعد الطبق إلى الحاضنة. فصل البلاعم المشتقة من iPSC عن القارورة باستخدام مكشطة الخلية. جهاز طرد مركزي عند 300 جم لمدة 5 دقائق.
بعد ذلك ، استنشق الطاف. ثم أعد تعليق البلاعم iPSC في 1 ملليلتر من وسائط MAC-CM2. خذ عينة سعة 10 ميكرولتر لعد الخلايا وضع الخلايا المتبقية على الجليد أثناء العد.
بعد العد ، انقل 300،000 من البلاعم إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر. جهاز الطرد المركزي للأنبوب عند 200 جم لمدة 5 دقائق. بعد الطرد المركزي ، أخرج الماصة الطافية من الأنبوب.
قم بإزالة الحضانات التي تحتوي على المزارع المشتركة للخلايا البطانية ومجرى الهواء من الحاضنة. قم بزرع 300،000 ضامة في 35 ميكرولتر من MAC-CM2 على الجانب القمي من إدراج ثقافة الخلايا.
