Minha pesquisa se concentra na compreensão da remodelação das vias aéreas humanas. As vias aéreas humanas servem como uma barreira contra toxinas ambientais, incluindo vírus, poluição do ar e fumaça do tabaco. Essas toxinas podem ferir as vias aéreas, fazendo com que mudem ou se remodelem, dificultando a respiração.
O sistema modelo inclui não apenas as células epiteliais que formam a barreira, mas outras células que são importantes na homeostase das vias aéreas, incluindo células dos vasos sanguíneos e células imunes chamadas macrófagos. Os desafios experimentais atuais incluem a modelagem do pulmão humano em um sistema modelo in vitro. A obtenção de amostras primárias de pulmão é difícil e também é muito difícil cultivá-las.
Assim, o uso de células-tronco das vias aéreas pulmonares derivadas de células-tronco investidas de células endoteliais e macrófagos é o próximo passo para superar esses desafios. Para começar, cubra o lado apical das inserções de cultura de células de poliéster de poros de 3 micrômetros com 4 miligramas por mililitro de solução de matriz extracelular, ou ECM. Pipetar a solução residual de ECM.
Em seguida, coloque a placa na incubadora por 1 hora a 37 graus Celsius. Usando uma pinça limpa, transfira esterilizadamente as inserções de cultura de células da placa de 12 poços para uma placa de Petri grande. Em seguida, cubra o lado basolateral das inserções de cultura de células com solução de MEC.
Depois de pipetar a solução residual de ECM, coloque a placa de Petri em uma incubadora de 37 graus Celsius para secar durante a noite. Lave o frasco T75 contendo células endoteliais derivadas de iPSC com PBS. Depois de aspirar a solução, adicione 5 mililitros de protease semelhante à tripsina ao frasco e incube a 37 graus Celsius por 8 minutos.
Bata no frasco para garantir que as células endoteliais se desprendam. Em seguida, transfira as células para um tubo cônico de 15 mililitros. Adicione 5 mililitros de meio de parada para interromper a dissociação.
Em seguida, centrifugue as células a 300 G por 5 minutos. Uma vez aspirado o sobrenadante, ressuspenda o sedimento celular em 1 mililitro de meio de cultura endotelial contendo 10 micromolares de inibidor de ROCK. Depois de aliquotar 150.000 células, ressuspenda em 100 microlitros de meio e pipete para o inserto de cultura de células invertido com o lado basolateral voltado para cima.
Transfira cuidadosamente as células para a incubadora e deixe-as intactas por 3 horas. Em seguida, em uma placa de 12 poços, adicione 1 mililitro de meio de cultura endotelial a cada poço. Remova a placa de Petri com células endoteliais da incubadora.
Usando uma pinça limpa, transfira cuidadosamente as inserções de cultura de células para a placa com meios de cultura endoteliais. Depois de verificar visualmente se as células endoteliais aderiram, coloque a placa em uma incubadora de 37 graus Celsius durante a noite. Depois de isolar os organoides do polímero ECM e tripsinizá-los por 15-20 minutos, adicione 3 mililitros de meio de parada para interromper a reação da protease.
Ressuspender a solução com uma pipeta P1000 e centrifugar a 400 g durante 5 minutos. Em seguida, aspire o sobrenadante dos organoides das vias aéreas e ressuspenda os organoides em 1 mililitro de meio de expansão das vias aéreas com 10 micromolares de inibidor de ROCK. Pegue uma amostra de 10 microlitros para uma contagem de células do hemocitômetro e coloque as células restantes no gelo durante a contagem.
Em seguida, semeie 300.000 células das vias aéreas derivadas de iPSC em 500 microlitros de meios de expansão das vias aéreas por inserção de cultura de células de 12 milímetros. Remova a placa com inserções de cultura de células contendo células endoteliais da incubadora de 37 graus Celsius. Ressuspenda as células das vias aéreas iPSC e pipete 500 microlitros contendo 300.000 células na câmara apical de cada inserto de cultura de células.
Coloque a placa em uma incubadora a 37 graus Celsius por 48 horas, mantendo as células apicais em condições líquido-líquido. Após a incubação, remova o meio do lado apical do inserto da cultura de células. Mude o meio basolateral para uma mistura 1:1 de meios de diferenciação das vias aéreas e meios de cultura endotelial.
Retorne a placa para a incubadora. Dissocie os macrófagos derivados de iPSC do frasco usando um raspador de células. Centrifugue a 300 G por 5 minutos.
Depois disso, aspire o sobrenadante. Em seguida, ressuspenda os macrófagos iPSC em 1 mililitro de meio MAC-CM2. Pegue uma amostra de 10 microlitros para contagem de células e coloque as células restantes no gelo durante a contagem.
Após a contagem, transferir 300.000 macrófagos para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Centrifugar o tubo a 200 G durante 5 minutos. Após centrifugação, pipetar o sobrenadante do tubo.
Remova as inserções contendo coculturas de células endoteliais e das vias aéreas da incubadora. Semeie 300.000 macrófagos em 35 microlitros de MAC-CM2 no lado apical do inserto de cultura de células.
